Ausgeprägte Nozizeptionsverarbeitung in den dysgranulären und Barrel-Regionen des somatosensorischen Kortex der Maus

Nature Communications Band 13, Artikelnummer: 3622 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Nozizeption, ein somatischer Unterscheidungsaspekt von Schmerz, wird wie Berührung im primären somatosensorischen Kortex (S1) repräsentiert, aber die Trennung und Interaktion der beiden Modalitäten innerhalb von S1 bleibt unklar. Hier zeigen wir räumlich unterschiedliche taktile und nozizeptive Verarbeitung im körnigen Fassfeld (BF) und der angrenzenden dysgranulären Region (Dys) bei Maus S1. Gleichzeitige Aufzeichnungen der Multiunit-Aktivität über Teilregionen hinweg ergaben, dass Dys-Neuronen stärker auf schädliche Eingaben reagieren, während BF-Neuronen taktile Eingaben bevorzugen. Auf der Ebene einzelner Neuronen werden nozizeptive Informationen getrennt von den taktilen Informationen in der Dys-Schicht 2/3 dargestellt. Im Gegensatz dazu scheinen beide Modalitäten auf einzelnen Schicht-5-Neuronen jeder Region zu konvergieren, allerdings in unterschiedlichem Ausmaß. Insgesamt zeigen diese Ergebnisse eine schichtspezifische Verarbeitung nozizeptiver und taktiler Informationen zwischen Dys und BF. Wir haben außerdem gezeigt, dass die Dys-Aktivität, nicht aber die BF-Aktivität, entscheidend an schmerzähnlichem Verhalten beteiligt ist. Diese Erkenntnisse liefern neue Einblicke in die Rolle der Schmerzverarbeitung in S1.

Der primäre somatosensorische Kortex (S1) spielt eine zentrale Rolle bei der taktilen Informationsverarbeitung1. Die taktile Darstellung in S1 ist somatotopisch geordnet2. Andererseits ist S1 für somatisch diskriminierende Aspekte der Schmerzverarbeitung verantwortlich, wie z. B. Ort, Intensität und Qualität des Schmerzes3,4,5,6,7,8,9,10. S1 empfängt thalamokortikale nozizeptive Informationen11 und leitet sie an andere schmerzbezogene kortikale Bereiche weiter, beispielsweise den anterioren cingulären Kortex, der für die affektiven Aspekte des Schmerzes verantwortlich ist12,13. S1 moduliert auch schädliche Inputs über die kortikotrigeminalen14 und kortikospinalen15 Bahnen sowohl bei akuten als auch bei chronischen Schmerzzuständen. Daher kann S1 als Netzwerkknotenpunkt der Schmerzverarbeitung und als Ziel für Interventionen zur Schmerzkontrolle angesehen werden. Es bleibt jedoch unklar, wie S1 nozizeptive Informationen und somatische taktile Informationen unterschiedlich verarbeitet.

Maus S1 ist aufgrund ihrer Zytoarchitektur in zwei Unterregionen unterteilt: die granuläre Region, die als Barrel Field (BF) bekannt ist und durch einzigartige Cluster von Schichtneuronen (L4) identifiziert wird, und die angrenzende dysgranuläre Region (Dys), die schlecht definiert ist L46,16. Es wird angenommen, dass die beiden Unterregionen funktional unterschiedlich sind. Beispielsweise ist BF das Zentrum für die Verarbeitung taktiler Eingaben von Schnurrhaaren17,18,19, während Dys propriozeptive Eingaben von tiefen Muskelstimulationen oder Gelenkrotationen erhält20,21. Bei der Nozizeption empfangen BF-Neuronen in tieferen Schichten schädliche Eingaben11,22,23. In ähnlicher Weise reagieren Dys-Neuronen in tieferen Schichten auf schädliches Kneifen und juckende Eingaben24,25. Wie jede Subregion nozizeptive Informationen mit/ohne taktile Informationen verarbeitet, bleibt jedoch unbekannt, da ein direkter Vergleich zwischen den beiden Subregionen fehlt.

Hier haben wir festgestellt, dass nozizeptive und taktile Informationen tendenziell getrennt in Dys bzw. BF dargestellt werden, indem beide Unterregionen gleichzeitig aufgezeichnet werden. Dys wurde auch vorwiegend bei neuropathischen Schmerzzuständen aktiviert, die durch eine Verletzung peripherer Nerven verursacht wurden. Die optogenetische Hemmung der neuronalen Aktivität von Dys, nicht jedoch von BF, spiegelt die räumlich unterschiedliche Darstellung der Nozizeption wider und reduzierte das durch schädliche Eingaben induzierte schmerzähnliche Verhalten. Somit haben wir eine bestimmte funktionelle Rolle bei der Schmerzverarbeitung bei Dys geklärt, die ein angemessenes Fluchtverhalten vor schädlichen Eingaben erzeugt.

Zunächst verglichen wir die Reaktionseigenschaften zwischen Dys und BF bei schädlichen Hitzereizen (noxH; 45–50 °C), die auf ein Whisker-Pad angewendet wurden (Abb. 1a). Obwohl die Septen innerhalb von BF hinsichtlich der Zytoarchitektur zur dysgranulären Region gehören, haben wir die dysgranuläre Zone um BF herum als Dys bezeichnet. Wir haben Multiunit-Aktivitäten (MUA) gleichzeitig von Dys- und BF-Neuronen in L2/3, L4, L5a und L5b aufgezeichnet. Der MUA in Dys stieg in allen aufgezeichneten Schichten an, wenn die Temperatur des Peltier-Geräts einen schädlichen Bereich (45–50 °C) erreichte, während die Reaktionen zwischen den Schichten in BF unterschiedlich waren: MUA zu noxH stieg in L2/3 oder L4 jedoch nicht an in L5a leicht erhöht (Abb. 1b). Um die Präferenz für noxH zu bewerten, wurde das Signal-Rausch-Verhältnis (S/N; siehe Methoden) berechnet. Als Signal wurde die Reaktion auf noxH (beschriftet mit S, beige schattierter Bereich in Abb. 1b) und die Reaktion auf einen unschädlichen Hitzebereich (33–45 °C, beschriftet mit N, grau schattierter Bereich in Abb. 1b) verwendet. wurde als Geräusch verwendet. Vergleiche gleichzeitig aufgezeichneter neuronaler Paare zeigten, dass Dys-Neuronen stärker auf noxH reagieren als BF-Neuronen (Abb. 1c, P = 0,0056 für L2/3, 0,0056 für L4 und 0,049 für L5a, n = 8 Tiere). Beim Vergleich der S/N-Werte für die gleichen Schichten zwischen Dys und BF war das S/N in Dys in L2/3 signifikant höher als in BF (P = 0,89 × 10−4, Mehrfachvergleichstest, Abb. 1d). Innerhalb von BF war das S/N in L5a signifikant höher als in L2/3 (P = 0,03, Abb. 1d). Dieser Unterschied zwischen den Schichten für noxH-Reaktionen in BF steht im Einklang mit früheren Studien22,23,26. Dieser Trend wurde auch beobachtet, als die Reaktion des Peltier-Geräts bei stationärer Temperatur (ca. 30 °C) als Rauschsignal zur Berechnung des S/N verwendet wurde. Zusammengenommen zeigte die MUA von Dys eine größere Empfindlichkeit gegenüber noxH als BF (Abb. 1e). Wir untersuchten auch die Expression von c-Fos, einem Marker für neuronale Aktivität, in dem Bereich innerhalb von S1, der auf schädliche Eingaben nach der Injektion von Capsaicin in das Whisker-Pad reagiert (ergänzende Abbildung 1a). Um zwischen Dys und BF zu unterscheiden, haben wir eine Co-Immunfärbung mit NeuN und VGluT2 durchgeführt, Markern für Neuronen bzw. thalamokortikale Terminals (ergänzende Abbildung 1b). Die Anzahl der c-Fos-positiven Neuronen stieg in L4 von Dys (P = 0,0027) und L5a von BF (P = 0,0249, ergänzende Abbildung 1c) signifikant an. Somit haben wir bestätigt, dass schädliche Einträge die oberflächlichen Schichten in Dys und L5a in BF aktivierten.

a Setup für die gleichzeitige Aufzeichnung von Dys und BF bei gleichzeitiger Anwendung schädlicher Wärmereize (noxH) auf das linke Whisker-Pad. Ein Gehirnschnitt mit Elektrodenspuren (DiI, rot). Die VGluT2-Färbung (grün) zeigt die Grenze von Dys und BF. Maßstabsbalken, 500 μm. b PSTHs repräsentativer MUA-Aufzeichnungen für noxH in L2/3, 4 und 5a von Dys und BF. Die schattierten Bereiche geben Bereiche zur Berechnung der S/N-Verhältnisse an. c Ein Streudiagramm des S/N gleichzeitig aufgezeichneter Multiunit-Aktivitäten als Reaktion auf einen noxH-Stimulus. P = 0,000023 für L2/3 (n = 25), 0,0056 für L4 (n = 17), 0,049 für L5a (n = 16) und 0,69 für L5b (n = 6) nach dem zweiseitigen Wilcoxon-Signed-Rank-Test. Die Diagonale zeigt Einheit an. d Statistischer Vergleich der S/N-Reaktionen auf noxH. *P = 0,030, **P = 0,89 × 10−4 nach dem Kruskal-Wallis-Test, gefolgt von Sidaks Test; n = 8 Tiere. Boxplots (Median mit dem 25. und 75. Perzentil). Datenpunkte jenseits der Whiskers werden durch Punkte angezeigt. e Ein zusammenfassendes Diagramm, das nozizeptive Regionen in S1 zeigt.

Als nächstes bewerteten wir die Reaktionspräferenz auf taktile Reize, indem wir das S/N als Reaktion auf Whisker-Ablenkungen verglichen (siehe Methoden). Neuronen in BF reagierten genau auf den Beginn jeder Whisker-Ablenkung, während dies in Dys nicht der Fall war (Abb. 2a, b). Das S/N für Whisker-Ablenkungen war bei BF in jeder Schicht höher als bei Dys (Abb. 2c, d), was darauf hinweist, dass die BF-Reaktionen stärker waren als die Dys-Reaktionen auf taktile Reize (Abb. 2e). Da das Whisker-Pad direkt durch Wärme stimuliert wurde, testeten wir seine Reaktion auf taktile Stimulation, indem wir einen Pinsel in das Whisker-Pad steckten (dies ist die äquivalente Position wie der Wärmereiz) und bestätigten, dass BF taktile Reize gegenüber Dys bevorzugt (ergänzende Abbildung). 2).

ein Setup zur Aufzeichnung der Reaktionen von Dys und BF auf taktile Stimulation der Schnurrhaare. Der schattierte Bereich gibt die Zeit an, die als Signal (S) und Rauschen (N) zur Berechnung des S/N der taktilen Eingabe verwendet wird. b Beispiele für PSTHs von MUA auf taktile Reize in L2/3, 4 und 5a von Dys und BF, die gleichzeitig aufgezeichnet wurden (siehe auch Abb. 1e). c Ein Streudiagramm des S/N gleichzeitig aufgezeichneter MUA zu taktilen Reizen. P = 0,0038 für L2/3 (n = 25), 0,028 für L4 (n = 17), 0,0002 für L5a (n = 16) und 0,063 für L5b (n = 6) nach dem zweiseitigen Wilcoxon-Signed-Rank-Test . Die Diagonale zeigt Einheit an. d S/N zu einem taktilen Reiz war in BF L2/3 höher. **P = 5,4 × 10−4 nach Kruskal-Wallis-Test, gefolgt von Sidaks Test; n = 8 Tiere. Boxplots (Median mit dem 25. und 75. Perzentil). Datenpunkte jenseits der Whiskers werden durch Punkte angezeigt. e Ein zusammenfassendes Diagramm, das taktile Präferenzbereiche in S1 anzeigt.

Die Ergebnisse der MUA-Analyse zeigten, dass es einige räumliche Verzerrungen für die nozizeptive Informationsverarbeitung zwischen Dys und BF gibt (Abb. 1). Daher untersuchten wir die Modalitätsspezifität einzelner Neuronen in zwei Unterregionen. L2/3 und 5 sind die kortikalen Ausgangsschichten, die Verbindungen zum motorischen und anterioren cingulären Kortex herstellen, die an schmerzähnlichem Verhalten beteiligt sind13,27. Peristimulus-Zeithistogramme (PSTHs) gut isolierter Neuronen in L2/3, die gleichzeitig aus den beiden Unterregionen aufgezeichnet wurden, sind in Abb. 3a dargestellt; Die aufgezeichneten Neuronen wurden nach dem Zeitpunkt der höchsten Reaktion auf einen Wärmereiz sortiert. Bei Dys L2/3 nahm die Steilheit der Spitzenreaktionen auf einen Hitzereiz innerhalb des schädlichen Hitzebereichs zu, was darauf hindeutet, dass die Mehrheit der Dys-Neuronen auf die schädliche Hitze reagierten. Im Gegensatz dazu reagierten in BF L2/3 nur wenige Neuronen (weißer Kasten in Abb. 3a, linke Spalte). Andererseits reagierten viele BF L2/3-Neuronen gut auf taktile Reize. Bemerkenswerterweise reagierten schädliche, auf Hitze reagierende Neuronen in Dys L2/3 nicht auf taktile Reize (weißer Kasten in Abb. 3a, rechte Spalte).

a PSTHs für die Reaktionen derselben Neuronen in L2/3, L5a und L5b auf schädliche Hitze (noxH) (links) und taktile (rechts) Reize. 50 ms/Bin für den Wärmereiz und 5 ms/Bin für den taktilen Reiz. Jede Zeile wurde nach der Spitzenreaktionszeit für noxH sortiert und die Feuerrate wurde anhand der Spitzenreaktion (eingerahmte Bereiche) in jeder Zeile normalisiert. b Mittelwerte aus den Histogrammen in den Feldern a und b, sortiert nach S/N zu noxH und taktilen Reizen: nozizeptive, taktile, integrative (nozizeptive und taktile) und nicht reaktive Zellen (keine) (siehe ergänzende Abbildung 3) . *P < 0,05 versus nicht reaktiv (zweiseitiger Kruskal-Wallis-Test, gefolgt von Tukey-Test). Schattierungen zeigen SEMs an. c Zelltypverteilungen in L2/3, L5a und L5b jedes Bereichs und ein zusammenfassendes Diagramm. d Verteilungen der thermischen Schwellenwerte, bestimmt aus der Temperatur, bei der die neuronalen Reaktionen 80 % der Spitzenspitzenrate erreichten. In L2/3 und L5b waren Dys-Neuronen auf schädliche Hitze eingestellt, während BF-Neuronen auf verschiedene Temperaturen reagierten (*P = 0,013, **P = 0,005, Ansari-Bradley-Test mit zwei Stichproben für Streuungen). e Prozentsätze der Neuronen, deren Reaktionen unterdrückt wurden (S/N < 1). ***P = 5,4 × 10−8, 2 × 2 χ2-Test zwischen BF und Dys.

Die Steilheit der Spitzenreaktionen auf Wärmereize nahm innerhalb des schädlichen Wärmebereichs in beiden Regionen in tieferen Schichten zu (weiße Kästchen in L5a und L5b in Abb. 3a, linke Spalte). Diese Tendenz weist darauf hin, dass nozizeptive Neuronen in tieferen Schichten vermehrt waren. Mit Ausnahme von Dys L5a reagierten nozizeptive Neuronen in L5 tendenziell auch auf taktile Reize (weiße Kästchen in Abb. 3a, rechte Spalte). Somit verarbeiten Dys-Neuronen in L2/3 nozizeptive Informationen getrennt von taktilen Informationen, während Neuronen in L5 dazu neigen, sowohl auf taktile als auch auf schädliche Eingaben zu reagieren.

Um diese Beobachtungen zu quantifizieren, haben wir die Neuronen entsprechend dem S/N gegenüber noxH und taktilen Reizen in nozizeptive, taktile, integrative und nichtreaktive Typen eingeteilt (Abb. 3b und ergänzende Abb. 3). Die Verteilungen des S/N geclustert nach dem mittleren S/N für alle aufgezeichneten Neuronen (1,46 für nozizeptive und 1,81 für taktile, ergänzende Abb. 3b, d, f, g). Darüber hinaus stellten normalisierte PSTHs von Neuronen, die nach diesen Werten klassifiziert wurden, die Merkmale jeder Neuronengruppe dar (Abb. 3b): Neuronen vom nozizeptiven Typ reagierten auf schädliche Hitze, jedoch nicht auf taktile Reize, Neuronen vom taktilen Typ reagierten auf taktile Eingaben, jedoch nicht auf schädliche Hitze und Neuronen vom integrativen Typ reagierten auf beide Reize. Daher haben wir das mittlere S/N als Grenzwert für die Klassifizierung verwendet. Gemäß dieser Klassifizierung wurde der Prozentsatz der Neuronen jedes Typs in jeder Subregion berechnet (Abb. 3c). In Übereinstimmung mit dem Populations-PSTH (Abb. 3a) wurden in den meisten Neuronen in L2/3 nozizeptive Informationen in Dys separat verarbeitet, während taktile Informationen in BF verarbeitet wurden. Darüber hinaus hatten viele Neuronen vom taktilen Typ in Dys L2/3 relativ längere Latenzzeiten bei der taktilen Stimulation als diejenigen in BF L2/3 (ergänzende Abbildung 4), was darauf hindeutet, dass diese Neuronen taktile Informationen von BF erhalten. Im Gegensatz dazu war die Einschaltlatenz von Neuronen vom integrativen Typ in L2/3 beider Regionen länger (ergänzende Abbildung 4).

In den tieferen Schichten wurden nozizeptive und taktile Informationen in den meisten Neuronen beider Unterregionen integriert (Abb. 3c, unten).

Da Dys- und BF-Neuronen in tieferen Schichten hauptsächlich auf schädliche Hitzestimulation reagierten, untersuchten wir auch neuronale Reaktionen auf schädliche mechanische Reize22. Wir untersuchten die hervorgerufenen Reaktionen auf einen von Frey (10 g) schädlichen mechanischen Reiz (ergänzende Abbildung 5). Die MUA von Dys und BF in L5b stieg bei Anwendung eines 10 g schweren von Frey-Filaments (ergänzende Abbildung 5a). Die MUA von BF L5b und Dys L5b erreichte eine maximale Reaktion, wenn sich das von Frey-Filament krümmte (dh das Whisker-Pad wurde mit 10 g stimuliert, ergänzende Abbildung 5b). Die Steilheit der maximalen Reaktionen auf schädliche Stimulation nahm in Dys L5b und BF L5b zu (ergänzende Abbildung 5b), was darauf hinweist, dass viele Neuronen in den tieferen Schichten auch auf schädliche mechanische Stimulation reagieren.

In den Populations-PSTHs (Abb. 3a) variierte der Beginn der Reaktion auf Wärmereize zwischen den Neuronen, insbesondere in BF L2/3 und L5b, was darauf hindeutet, dass die Neuronen auf unterschiedliche Temperaturen reagierten. Daher untersuchten wir die Temperaturempfindlichkeit von Neuronen ab der thermischen Schwelle (80 % maximale Reaktion) als Reaktion auf den Wärmereiz (Abb. 3d). L2/3-Neuronen in beiden Regionen begannen bereits bei unschädlichen Temperaturen (–44 °C) zu reagieren. Die Verteilungen der thermischen Schwelle von Dys-Neuronen, jedoch nicht von BF-Neuronen, waren in L2/3 (P = 0,013) und L5b (P = 0,0051) signifikant um den Bereich der schädlichen Hitze akkumuliert (Abb. 3d). Diese Daten legen nahe, dass Dys-Neuronen gut auf schädliche Hitzetemperaturen abgestimmt sind, wohingegen Neuronen in BF L2/3 und L5b Hauttemperaturen kodieren28,29.

Die durchschnittlichen PSTHs (Abb. 3b) zeigen, dass die neuronalen Aktivitäten taktiler und nicht reaktiver Neuronen durch noxH unterdrückt wurden. Da das S/N dieser Neuronen <1 war, haben wir den Prozentsatz der durch noxH unterdrückten Neuronen in jeder Region geschätzt. In BF L2/3 wurden 60 % der Neuronen durch noxH unterdrückt (Abb. 3e). Dieser Prozentsatz ist deutlich größer als der in Dys (22 %, P = 5,4 × 10−8). Diese Daten könnten den neuronalen Mechanismus erklären, der Defiziten der taktilen Wahrnehmungsunterscheidungsfähigkeit unter Schmerzen zugrunde liegt30,31.

Zusammenfassend zeigen die Daten, dass nozizeptive Informationen getrennt von taktilen Informationen in der oberflächlichen Schicht von Dys und BF verarbeitet werden und dazu neigen, in tiefere Schichten integriert zu werden. Der Unterschied in den thermischen Schwellenwerten weist darauf hin, dass Dys schädliche Wärmeeinträge verarbeitet und BF für die Temperaturkodierung verantwortlich ist.

Als nächstes untersuchten wir, ob die Dys-Aktivität eine Schmerzverarbeitung unter pathophysiologischen Bedingungen beinhaltet. Es wurde vorgeschlagen, dass S1 bei chronischen Schmerzen aktiviert wird12,13,32,33 und dass eine Verletzung peripherer Nervenfasern eine somatotopische Reorganisation und mechanische Überempfindlichkeit verursacht34,35,36,37,38,39. Daher haben wir ein Trigeminusneuralgie-Modell durch Ligation des Nervus infraorbitalis (ION) angewendet und untersucht, wie sich die räumliche kortikale Aktivität in S1 während der Entwicklung einer mechanischen Allodynie verändert. Zu diesem Zweck verwendeten wir einen resorbierbaren chirurgischen Faden (siehe Methoden), der es uns ermöglichte, den Zustand der mechanischen Allodynie und den Erholungszustand bei demselben Tier zu beobachten.

Wir untersuchten zunächst den zeitlichen Verlauf der Entwicklung mechanischer Allodynie durch die ION-Ligation, der anhand der Fluchtschwelle im von-Frey-Filament-Test bewertet wurde. Die Mäuse zeigten Allodynie, wenn die Zugfestigkeit des chirurgischen Fadens etwa 50 % betrug, und erholten sich, als die Zugfestigkeit auf 0 % der maximalen Festigkeit reduziert wurde (ergänzende Abbildung 6).

Als nächstes zeichneten wir intrinsische Signale auf, die durch Whisker-Stimulation kontinuierlich vom selben Tier vor und während des mechanischen Allodynie-Zustands (POD7) und des Erholungszustands (POD21, Abb. 4a, b) induziert wurden. Vor der Ligation wurden deutliche intrinsische Signale in BF beobachtet, die durch Whisker-Stimulation induziert wurden (Abb. 4b, links). Im Allodynie-Zustand (POD7) verschwand das Signal in BF, wurde jedoch in der angrenzenden Region verstärkt (Abb. 4b, Mitte), obwohl der Signalkontrast relativ gering war (Abb. 4b). Im Wiederherstellungszustand (POD21) erschien das Signal in BF wieder (Abb. 4b, rechts). Nach einer Aufzeichnungsreihe bestätigten wir in einer anschließenden histologischen Analyse, dass es sich bei der angrenzenden BF-Region, in der das Signal bei POD7 erkannt wurde, um Dys handelte (Abb. 4c und ergänzende Abb. 7).

a Schematische Darstellung der Bildgebung des intrinsischen Signals während der Whisker-Stimulation durch das Piezogerät. Eine rote LED wurde für die Bildgebung des intrinsischen Signals verwendet, und eine grüne LED wurde verwendet, um das Gefäßmuster der Gehirnoberfläche zu erhalten. b Oben: Schematische Darstellung des zeitlichen Verlaufs der Ligatur des Nervus infraorbitalis (ION) durch einen resorbierbaren chirurgischen Faden. Mitte: Typische Beispiele für die intrinsischen Signalbilder eines Tieres. Unten: Überlagerte Bilder der Signalregion (gelb) und des Gefäßmusters, die für die Ausrichtung verwendet wurden. c Cytochrom-c-Oxidase-Färbung eines tangentialen Abschnitts von S1 L4. FP, Vorderpfote; HP, Hinterpfote. d Gemittelte Z-Score-Bilder (Ligationsgruppe, n = 5; Scheingruppe, n = 3). Die gepunkteten Bereiche zeigen BF an, das durch die Whisker-Stimulation vor der Ligation aktiviert wurde. R, rostral; L, seitlich; POD, postoperativer Tag. Maßstabsbalken, 1 mm.

Um die neuronale Aktivität von Dys während der Ligation und Erholung zu bestätigen, haben wir die durch den Reiz hervorgerufene MUA in Dys und BF bei POD7 und POD21 bei einzelnen Tieren aufgezeichnet (ergänzende Abbildung 8a, b). Das Aktivitätsgleichgewicht zwischen BF und Dys war verändert (ergänzende Abbildung 8a, b). Die Dys-Aktivität war bei einigen Tieren während der Ligation an POD7 höher als bei BF (ergänzende Abbildung 8a); Darüber hinaus erholte sich die BF-Aktivität bei POD21 (ergänzende Abbildung 8b). Ergebnisse der intrinsischen Signalbildgebung aus der räumlichen Summierung der neuronalen Aktivität und elektrophysiologischen Aufzeichnungen lokalisierter neuronaler Aktivität können daher Änderungen der Dys-Aktivität unterschätzen. Dementsprechend zählten wir auch c-Fos-positive Neuronen in Mäusen, nachdem die Mäuse eine angereicherte Umgebung erkundet hatten (siehe Methoden, ergänzende Abbildung 9a). In Übereinstimmung mit den Ergebnissen der intrinsischen Signalbildgebung war die Anzahl der c-Fos-positiven Neuronen bei Dys signifikant erhöht, bei BF jedoch bei POD7 zurückgegangen. Bei POD21 wurde jedoch die Anzahl der c-Fos-positiven Neuronen in BF wiederhergestellt (ergänzende Abbildung 9b, c). Somit veränderte sich die aktivierte Region dynamisch entsprechend dem Ausmaß der peripheren Nervenverletzung und die neuronale Aktivität in Dys war im schmerzähnlichen Zustand erhöht.

Schließlich untersuchten wir, ob Dys an schmerzähnlichem Verhalten beteiligt ist, beispielsweise an der Flucht vor schädlichen Reizen. Zu diesem Zweck überwachten wir das Verhalten kopfgestützter Tiere, die sich frei auf einem kugelförmigen Laufband42 bewegten, als Reaktion auf einen unschädlichen oder schädlichen Infrarotlaser (IR), der auf das linke Schnurrbartpolster aufgetragen wurde (Abb. 5a). Die Anwendung des IR-Lasers für 500 und 1500 ms erhöht die Hauttemperatur auf 39 °C bzw. 52 °C43, die wir daher als unschädliche Hitze (innH) bzw. noxH bezeichnen. Als Reaktion auf noxH erhöhte sich die Laufgeschwindigkeit bis 5 s nach Einsetzen des IR-Laserreizes und die Laufrichtung änderte sich zur entgegengesetzten Seite des schädlichen Eintrags, als die Mäuse versuchten, dem schädlichen Eintrag zu entkommen (Abb. 5b – d und). Ergänzende Abbildung 10a, Richtung). Die Tiere zeigten auch ein Blinzeln und Anziehen der Augen (ergänzende Abbildung 10a), die als Ausdruck von Schmerz angesehen werden44,45,46. Somit eignete sich dieses System zur Quantifizierung schmerzähnlichen Verhaltens als Reaktion auf noxH.

ein Schema zur Überwachung des Fluchtverhaltens, das durch die Anwendung eines 808-nm-Infrarotlasers (IR) auf die linke Schnurrbartpolsterung eines kopfgestützten, sich frei bewegenden Tieres auf einem kugelförmigen Laufband induziert wird. Bewegungsrichtung und -geschwindigkeit wurden von einer Kamera auf der Rückseite überwacht, Gesichtsausdruck und Bewegung der Vorderbeine wurden von Seitenkameras überwacht. b Beispiele für die Fluchtgeschwindigkeit als Reaktion auf IR-Stimulationen von 500 und 1500 ms, entsprechend 0,09 (unschädliche Hitze, innH) bzw. 0,27 J/mm2 (noxH). c Durchschnittliche Geschwindigkeitsprofile mit (innH, orange; noxH, rot) und ohne (schwarz) IR-Stimulation (n = 6 Mäuse). *P < 0,05, **P < 0,01. d Durch IR-Stimulation induzierte Maximalgeschwindigkeiten (n = 6 Mäuse, ns, nicht signifikant; **P = 3,1 × 10−6 (keine Stimulation vs. noxH), 0,0055 (innH vs. noxH); einfache ANOVA, gefolgt von der Tukey-Kramer-Test.). e Schema zur Stummschaltung von sechs S1-Positionen (430 μm voneinander entfernt) durch 473-nm-Photoaktivierung von Channelrhodopsin-2 (ChR2) während der noxH-Stimulation. Maßstabsleiste, 1 mm. +, bregma; R, rostral; L, seitlich; D, dorsal. f Durchschnittsgeschwindigkeitsprofile zeigen, dass die optogenetische Unterdrückung bei P3 (blau) oder P4 (cyan) die Fluchtgeschwindigkeit zu noxH (n = 6 Mäusen) signifikant reduzierte. *P < 0,05. g Mittlere Z-Scores der Maximalgeschwindigkeit (n = 6 Mäuse). **P = 2,3 × 10−5 (noxH vs. P3), 2,0 × 10−4 (noxH vs. P4); einfaktorielle ANOVA, gefolgt vom Tukey-Kramer-Test. Schattierungen und Fehlerbalken zeigen SEMs für Mäuse an.

Mit diesem System untersuchten wir die Auswirkung der Modulation der Dys-Aktivität auf schmerzähnliches Verhalten. Wir überwachten durch noxH induziertes schmerzähnliches Verhalten während der optogenetischen Unterdrückung verschiedener kortikaler Bereiche, einschließlich Dys (Abb. 5e). Für dieses Experiment haben wir das Blinzeln oder Anspannen der Augen nicht bewertet, da diese Reflexaktionen über den Hirnstamm und das Kleinhirn beinhalten47. Wir verwendeten eine transgene Linie, die Channelrhodopsin-2 (ChR2)-EYFP in Parvalbumin (PV)-exprimierenden Interneuronen (PV-Cre × Ai32) exprimiert, und photoaktivierten die PV-Interneuronen, um kortikale Pyramidenneuronen lokal zu hemmen48,49,50 (Abb. 5e) . Da es sich bei Dys um einen schmalen Bereich (ungefähr 0,4 mm) handelt, der an BF angrenzt (Tangentialschnitt, Abb. 4c), ist es eine Herausforderung, Dys zu stimulieren und gleichzeitig BF oder die Pfotenregion auszuschließen. Wir haben daher die Laserstimulationspositionen an sechs Punkten geändert und dann die Verhaltensweisen verglichen48,50. Die Photoinhibition an Position 3 (P3) und P4, die hauptsächlich Dys und teilweise die Pfotenregion oder BF abdeckte, verringerte die Fluchtgeschwindigkeit als Reaktion auf noxH signifikant (1,5 bis 2 s bei P3 und P4, P < 0,05; und 2 bis 2,5 s). bei P4, n = 6, Abb. 5f). Im Gegensatz dazu hatte die Photoinhibition anderer S1-Regionen wie BF- oder Pfotenregionen keine Wirkung (P > 0,05, ergänzende Abbildung 11). Ähnliche Trends wurden für die Höchstgeschwindigkeit (P <0, 01 bei P3 und P4, an anderen Positionen nicht signifikant, Abb. 5g) und für Änderungen der Fluchtrichtung und -entfernung (ergänzende Abb. 10b) beobachtet. Zusammenfassend haben wir bestätigt, dass die Photoinhibition an P3 und P4 das Fluchtverhalten von Mäusen unterdrückt, die in die entgegengesetzte Richtung des schädlichen Eintrags laufen. Bei Kontrollmäusen, die kein ChR2 exprimierten, hatte die Stimulation mit blauem Laser keinen Einfluss auf die Fluchtgeschwindigkeit (ergänzende Abbildung 12). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die optogenetische lokale Unterdrückung von Dys-Neuronen das durch noxH hervorgerufene schmerzähnliche Verhalten reduzierte.

Um diese Beobachtung zu untermauern, haben wir die Thalamokortikalfaser photoaktiviert, um Dys zu aktivieren. Da angenommen wird, dass Neuronen des medialen hinteren Kerns (POm) nozizeptive Informationen vom Thalamus zu S111 übertragen, haben wir die Verbindung von POm-Neuronen zu Dys durch retro- und anterograde Tracer bestätigt (ergänzende Abbildung 13)16 und Mäuse mit dem Virus induziert Expression von ChR2 (AAV9-hSyn-ChR2(H134R)-EYFP) in POm-Neuronen (ergänzende Abbildung 14a)16. Anhand dieser Mäuse beobachteten wir, dass die Photoaktivierung von Dys als Reaktion auf innH zu Geschwindigkeitsprofilen auf dem Laufband führte, die denen als Reaktion auf noxH ähnelten (ergänzende Abbildung 14b). In ähnlicher Weise war die maximale Geschwindigkeit mit innH gepaart mit Dys-Photoaktivierung nahezu dieselbe wie die als Reaktion auf noxH (P = 0, 99, ergänzende Abbildung 14c). Ähnliche Trends wurden für Fluchtrichtung und -entfernung beobachtet (Ergänzende Abbildung 14d, e). Diese Ergebnisse zeigen, dass die ChR2-vermittelte Photoaktivierung von Dys schmerzähnliches Verhalten verstärkt. Bei Kontrollmäusen, denen ChR2 in POm fehlte, hatte die Stimulation mit blauem Laser keine Wirkung (ergänzende Abbildung 14f – j). Zusammenfassend zeigen die optogenetischen Studien, dass die Dys-Hemmung schmerzähnliches Verhalten reduziert, während die Dys-Aktivierung diese als Reaktion auf innH induziert, was die Rolle von Dys bei der Erzeugung schmerzähnlichen Verhaltens aufzeigt.

Diese Studie zeigt, dass Dys eine hohe Empfindlichkeit gegenüber schädlichen Eingaben zeigt, während BF taktile Eingaben bevorzugt. Insbesondere werden in Dys L2/3 nozizeptive Informationen getrennt von taktilen Informationen verarbeitet. Dys reagiert auch auf neuropathische Schmerzen. Die optogenetische Unterdrückung der Dys-Aktivität spiegelt die räumlich unterschiedliche Darstellung der Nozizeption wider und reduzierte schädliche, durch Hitze hervorgerufene schmerzähnliche Verhaltensweisen, wohingegen die gleiche Manipulation bei BF keine Verhaltenseffekte zeigte. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Dys an der Nozizeption und der Entstehung schmerzähnlicher Verhaltensweisen beteiligt ist.

Frühere Studien haben berichtet, dass sich noziresponsive kortikale Neuronen in den tieferen Schichten von BF11,22,23 und Dys24 befinden, die funktionellen Unterschiede zwischen den beiden Unterregionen sind jedoch weiterhin unbekannt. Hier zeigen wir, dass Dys und BF getrennte Rollen bei der nozizeptiven und taktilen Verarbeitung spielen, insbesondere in L2/3. Unsere neurophysiologischen Daten zeigen außerdem, dass der noxH-Input die neuronale Aktivität in BF L2/3 unterdrückt. Diese Unterdrückung könnte die neuronale Grundlage für die Störung der Schärfe des Tastempfindens bei Schmerzen sein30,31.

Im Gegensatz zu L2/3 war die Trennung von nozizeptiver und taktiler Informationsverarbeitung in L5b weniger klar, mit größeren Anteilen integrativer Neuronen in beiden Regionen. Die Präferenz für taktile Reize in L5-BF-Neuronen blieb jedoch bestehen; BF-Neuronen bevorzugten taktile Eingaben stärker als Dys-Neuronen (Abb. 2c). Da angenommen wird, dass L5-Neuronen nozizeptive Eingaben über den kortikofugalen Weg modulieren14,15, könnten BF-L5-Neuronen unter normalen Bedingungen mit der berührungsinduzierten Schmerzlinderung in Zusammenhang stehen51, während Dys-L5-Neuronen möglicherweise zur mechanischen Allodynie beitragen (Abb. 4).

Das bemerkenswerte Ergebnis der vorliegenden Studie ist, dass Dys, nicht jedoch BF, an der Erzeugung von Fluchtverhalten beteiligt ist (Abb. 5). Für ein angemessenes Fluchtverhalten muss das Tier in eine Richtung weg vom schädlichen Eintrag laufen (Abb. 5d und ergänzende Abb. 10a). Die Inaktivierung von Dys durch die optogenetische Aktivierung lokaler PV-Interneuronen verringerte die Fluchtgeschwindigkeit und störte die Richtungsselektivität, um schädlichen Eingaben zu entkommen (Abb. 5g und ergänzende Abb. 10b). Mehrere anatomische Beweise deuten darauf hin, dass Dys eng mit der motorischen Funktion und der Schmerzverarbeitung zusammenhängt. Dys beispielsweise empfängt propriozeptive Eingaben über POm16,20,21 und projiziert diese auf den primären motorischen Kortex27. Dys projiziert auch auf den anterioren cingulären Kortex27, der sensorischen und affektiven Schmerz integriert und schmerzähnliches Verhalten moduliert12,13. Darüber hinaus hat Dys eine neuronale Verbindung mit dem sekundären somatosensorischen Kortex27, der an der Verarbeitung nozizeptiver Informationen52,53 beteiligt ist. Es ist daher wahrscheinlich, dass Dys-vermittelte neuronale Netzwerke ein angemessenes Fluchtverhalten fördern, indem sie die Verarbeitung von Propriozeption und Nozizeption integrieren.

Die Photoaktivierung thalamokortikaler Fasern, die von POm nach Dys vorstehen, induzierte ein Fluchtverhalten (ergänzende Abbildung 14) und bestätigte die Ergebnisse der optogenetischen Hemmung von Dys (Abb. 5). Da Neuronen im POm auf Dys L4 und BF L516,54,55 projizieren (ergänzende Abbildung 13b), ist es möglicherweise nicht möglich, den Beitrag von BF vollständig auszuschließen. Die BF-Aktivierung reduziert schmerzähnliches Verhalten durch die Feedforward-Hemmung der kortikotrigeminalen Axone von L514. Darüber hinaus enden die absteigenden Projektionen von Dys in Bereichen, die sich von denen der S1-Hautregionen unterscheiden, wie z. B. BF56. In Anbetracht dieser Berichte ist in der aktuellen Studie die Photoaktivierung von POm-S1-Fasern, die Schmerzverhalten auslösen, eine Folge der POm-Dys-Faseraktivierung. Diese Ergebnisse legen nahe, dass Dys und BF unterschiedliche Auswirkungen auf Flucht- und schmerzähnliches Verhalten haben.

Es wurde vermutet, dass die Steuerung der S1-Aktivität die Schmerzschwellen moduliert14,33. Da die Manipulation der Dys-Aktivität das schmerzähnliche Verhalten steuert (Abb. 5), könnte die selektive Hemmung der noziresponsiven Region in S1 ein therapeutisches Ziel in der klinischen Schmerzbehandlung sein, ohne andere Funktionen von S1 zu beeinträchtigen. Zerebrale kortikale Läsionen in S1 bewirken eine dauerhafte Schmerzlinderung (Übersicht bei Whitsel et al.57). Neuronen im Bereich 3a nichtmenschlicher Primaten, einer dysgranulären Region basierend auf ihrer Zytoarchitektur57, reagieren auf schädliche8,57,58 und propriozeptive Eingaben59. Diese Beobachtungen und phylogenetischen Beziehungen60 legen nahe, dass Primatenbereich 3a ein evolutionäres Homolog zu Nagetier-Dys ist. Darüber hinaus könnte der menschliche Bereich 3a eine zentrale Rolle bei der Schmerzwahrnehmung spielen61. Daher kann der menschliche Bereich 3a eines der idealen Interventionsziele zur Schmerzlinderung sein. Allerdings ist Bereich 3a beim Menschen im Fundus des zentralen Sulcus vergraben62. Daher stellt die selektive Intervention im Bereich 3a eine Herausforderung dar und muss für eine wirksame Behandlung chronischer Schmerzen in der Zukunft gelöst werden57,58. Dennoch deuten unsere Ergebnisse stark darauf hin, dass die ausgeprägte nozizeptive Region in S1 ein potenzielles therapeutisches Ziel zur Schmerzlinderung darstellt.

Alle chirurgischen Eingriffe und die postoperative Pflege wurden gemäß den Richtlinien des Animal Care and Use Committee der Tokyo Women's Medical University durchgeführt. Alle Tierversuche wurden unter der Nummer AE19-109 genehmigt. C57BL/6 N (Sankyo Lab. Service Corp., Tokio, Japan), PV-Cre (JAX-Aktiennummer 008069) und Ai32 (Rosa-CAG-LSL-ChR2[H134R]-EYFP-WPRE; JAX-Aktiennummer 012569) In dieser Studie wurden Mauslinien verwendet. PV-Cre-Mäuse wurden mit Ai32-Mäusen gekreuzt und die resultierende Mauslinie wurde als PV-ChR2 bezeichnet. Es wurden männliche Mäuse im Alter von 8 Wochen oder älter verwendet. Die Tiere wurden in Gruppen in einem Käfig gehalten, der bei 23 °C ± 1 °C, 50 ± 15 % Luftfeuchtigkeit und einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus gehalten wurde, und alle Verhaltenstests wurden während der Dunkelperiode durchgeführt. Es wurden alle Anstrengungen unternommen, um die Anzahl der verwendeten Mäuse und deren Leiden in dieser Studie zu minimieren. Für chirurgische Eingriffe wurde jedes Tier mit einer intraperitonealen Injektion von Ketamin (100 mg/kg Körpergewicht) und Xylazin (16 mg/kg Körpergewicht) anästhesiert und Isofluran wurde ergänzt, um die Anästhesie aufrechtzuerhalten. Zur topischen Anästhesie wurde Lidocain subkutan an der Inzisionsstelle und an den Wundrändern aufgetragen. Für die optische Bildgebung intrinsischer Signale, elektrophysiologische Aufzeichnungen und Verhaltenstests auf einem sphärischen Laufband wurde eine speziell angefertigte Kopfplatte mit klarem Zahnacrylharz (Super-Bond; Sun Medical, Shiga, Japan) am Schädel befestigt. Die mit einer Kopfplatte implantierten Tiere wurden in den Heimkäfig zurückgebracht und durften sich mindestens 4 Tage lang von der Operation erholen.

Für elektrophysiologische Aufzeichnungen von Dys und BF wurde jede Maus mit Isofluran (0,4–0,8 %) und einer intraperitonealen Injektion von Chlorprothixenhydrochlorid (2 mg/kg Körpergewicht) anästhesiert63. Da die nozizeptive Reaktion vom Grad der Anästhesie abhängt64, wurde die Atemfrequenz (70–120 Zyklen/s) überwacht, um den Grad der Anästhesie zu kontrollieren.

Wir identifizierten zunächst die Grenze zwischen Dys und BF anhand der Bildgebung des intrinsischen Signals durch Whisker-Stimulation (siehe „Optische Bildgebung des intrinsischen Signals“). Anschließend wurden mit DiI (V22885, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) gefärbte 32-Kanal-Vierschaftelektroden (A4x8 oder Buzsaki32; NeuroNexus, Ann Arbor, MI, USA) sowohl in Dys als auch in BF eingeführt. Wir haben gleichzeitig die neuronale Aktivität jeder Region mit den Empfangsfeldern der E-Reihen-Whisker aufgezeichnet. Um Neuronen mit rezeptiven Feldern aufzuzeichnen, die die Whisker der E-Reihe und das Whisker-Pad um die E-Reihe abdecken65, wurden mindestens zwei Schäfte im Lauf der E-Reihe und Dys neben dem Lauf der E-Reihe positioniert (Abb. 1a).

Rohe elektrische Signale wurden mit 40 kHz verstärkt und digitalisiert (Plexon, Dallas, TX, USA) und dann für die Spike-Sortierung verarbeitet. Die Spike-Sortierung umfasste die automatische Spike-Erkennung und Clustering mit Klusta (Version 3.0.16), gefolgt von einer manuellen Sortierung mit Kwik GUI (v1.0.9)66. Zunächst wurden aus der Wellenform ermittelte Rauschartefakte extrahiert. Zweitens wurde die Multiunit-Aktivität (MUA) aus der Wellenform mit niedriger Amplitude und ohne Refraktärzeit (>2 ms) in den Autokorrelogrammen bestimmt. Drittens wurde nach dem Zusammenführen und/oder Aufteilen der Cluster mithilfe von Auto- und Kreuzkorrelogrammen und Hauptkomponentenmerkmalen die Single-Unit-Aktivität (SUA) ermittelt, die in den Autokorrelogrammen eine klare Refraktärzeit (>2 ms) aufweist, oder MUA bestimmt. Um die Tiefe der aufgezeichneten Neuronen abzuschätzen, wurden die maximalen Amplituden der Wellenformen jeder Sonde verglichen und für die nächstgelegene Sonde für jede SUA/MUA bestimmt. Für die MUA-Analyse wurde SUA einbezogen (n = 8 Tiere, 128 Sondenstellen gleichzeitig für die MUA-Analyse aufgezeichnet).

Für die elektrophysiologische Datenanalyse des Bürstens auf dem linken Whisker-Pad (ergänzende Abbildung 2), der von-Frey-Stimulation (ergänzende Abbildung 5) und der Stimulation während der ION-Ligation (ergänzende Abbildung 8) wurden rohe elektrische Signale bei 30 verstärkt und digitalisiert kHz (Open Ephys67, Open Ephys GUI, v0.5.0) und dann für die Spike-Sortierung verarbeitet. Die Spitzensortierung umfasste die automatische Spitzenerkennung und Clusterbildung mit Kilosort (v2.0, https://github.com/cortex-lab/KiloSort), gefolgt von der manuellen Sortierung mit Phy (v2.0b1, https://phy.readthedocs.io/ en/aktuell/). Für die MUA-Analyse bei POD7 und POD21 (ergänzende Abbildung 8) verwendeten wir für jede Aufzeichnung dieselbe 32-Kanal-4-Schaft-Elektrode (Buzsaki32). Anschließend wählten wir die beiden benachbarten Schenkel in Dys und BF aus und verglichen die Gesamtzahl der von jedem Schenkel aufgezeichneten Spitzen.

Nach den Aufzeichnungen wurden die Mäuse mit Natriumpentobarbital (60 mg/kg Körpergewicht, intraperitoneal) tief anästhesiert und transkardial mit einer Fixierlösung (4 % Paraformaldehyd und 0,2 % Pikrinsäure in 0,1 M Phosphatpuffer) perfundiert. Die Gehirne wurden entnommen und koronal in 50 μm große Abschnitte geschnitten. Die Schnitte wurden über Nacht mit einem polyklonalen Meerschweinchen-Antikörper gegen VGluT2 (Meerschweinchen; 1:500, MSFR106290, Nittobo Medical Co., Ltd., Tokio, Japan) inkubiert, gefolgt von NeuroTrace 435/455 (1:100; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA), um die Aufnahmeorte zu identifizieren. Die Bilder wurden mit einem aufrechten Mikroskop (AxioScope.A1, Zeiss, Deutschland) mit einer gekühlten CCD-Kamera (RS 6.1 s, QSI, Cambridge, England) mit µManager (Version 1.4, https://micro-manager.org/) aufgenommen. ).

Wir haben das S/N berechnet, um die Flächen- oder Zelleigenschaften zu identifizieren und die Selektivität gegenüber schädlicher Hitze und taktilen Reizen zu bewerten. Ein Peltier-Gerät (4,2 mm × 4,0 mm) wurde auf dem linken Whisker-Pad platziert, um den Wärmereiz auszuüben. Um die Wärmeübertragung auf die Haut zu gewährleisten, wurden winzige Härchen zwischen den Barthaaren mit Haarentfernungsschaum entfernt, sodass die Barthaare intakt blieben. Für das S/N der schädlichen Wärmereaktion wurde die Reaktion für 500 ms bei 45–50 °C für das Peltier-Gerät (beige Schattierung, Abb. 1e) als S-Reaktion gezählt. Die harmlose Wärmereaktion (für 1000 ms bis 45 °C, entsprechend 33–45 °C, graue Schattierung, Abb. 1e) wurde als N-Reaktion gezählt. Diese Definition half bei der Auswahl schädlicher wärmeselektiver Neuronen, indem temperaturkodierende Neuronen ausgeschlossen wurden.

Bei taktilen Reizen wurde die Reaktion 30 ms nach Beginn der Whisker-Ablenkung (blaue Pfeile, Abb. 2a, rechts) als S-Reaktion gezählt. Die Reaktion für 60 ms bis zum Einsetzen der Whisker-Ablenkung wurde als N-Reaktion gezählt (Abb. 2a). Für diese Berechnung wurden alle Durchbiegungen verwendet (Abb. 2b). Diese Definition half zu erkennen, wie das Neuron auf eine sequentielle Whisker-Ablenkung reagiert68.

Als Reiz für mechanischen Schmerz wurde ein von Frey-Filament (10 g) auf das linke Whisker-Pad aufgetragen. Alle Barthaare und winzigen Härchen zwischen den Barthaaren auf dem linken Barthaarpad wurden entfernt, um die Anwendung des 10-g-Von-Frey-Filaments auf der Haut festzustellen. Alle Stimulationsversuche wurden mit einer Hochgeschwindigkeitskamera mit 200 Hz (XiQ, Ximea GmbH, Münster, Deutschland) überwacht. Der interessierende Bereich wurde auf dem Whisker-Pad platziert und die Biegung der Haut berechnet (Farbdiagramme in der ergänzenden Abbildung 5a). Ein Sättigungspunkt der Biegung der Haut identifizierte den Beginn der Biegung des von Frey-Filaments.

Capsaicin (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka, Japan) wurde in 100 % Ethanol und 7 % Tween 80 in Kochsalzlösung (10 mM) gelöst. Als Vehikel wurde eine Lösung verwendet, die 100 % Ethanol, 7 % Tween 80 und Kochsalzlösung enthielt69. Die Tiere wurden in ihre Heimkäfige aus der Tierhaltung überführt und mit 2 % Isofluran betäubt. Nach der Injektion von Capsaicin (50 μl) oder Vehikel (50 μl) in das linke Schnurrhaarpolster wurden die Mäuse wieder in ihre Heimkäfige gesetzt und in die Tierhaltung zurückgebracht.

Drei Stunden nach der Injektion wurden die Mäuse mit Isofluran (2–3 %, 5 Min.) tief anästhesiert und transkardial mit einer präfixierenden Lösung (250 mM Saccharose und 5 mM MgCl2 in 0,02 M phosphatgepufferter Kochsalzlösung, pH 7,4), die Heparinnatrium enthielt, perfundiert Salz (30–40 Einheiten/ml), gefolgt von einer Fixierlösung (4 % Paraformaldehyd und 0,2 % Pikrinsäure in 0,1 M phosphatgepufferter Lösung). Die Gehirne wurden 12–16 Stunden lang bei 4 ° C in frischem Fixiermittel nachfixiert und mit einem Vibratom (VT1000S, Leica Microsystems Inc, Wetzlar, Deutschland) koronal in 40 μm dicke Schnitte geschnitten. Die Schnitte wurden 12–16 Stunden lang bei 20–25 °C mit einer Mischung aus polyklonalem Kaninchen-Antikörper gegen c-Fos (1:2000; 226 003, Synaptic Systems GmbH, Göttingen, Deutschland), einem polyklonalen Meerschweinchen-Antikörper gegen VGluT2 ( 1:500; MSFR106290, Nittobo Medical Co., Ltd., Tokio, Japan), ein polyklonaler Ziegen-Antikörper gegen Calbindin D-28K (1:500; MSFR100410, Nittobo Medical Co., Ltd.) und ein monoklonaler Maus-Antikörper gegen NeuN (1:500; MAB377, Merck, Darmstadt, Deutschland) in 0,05 M phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), die 10 % normales Eselserum und 0,3 % Triton X-100 enthält. Nach 2–3-maligem Waschen mit PBS wurden die Schnitte 2–3 Stunden lang bei 20–25 °C mit sekundären Antikörpern weiter inkubiert, die an Alexa Fluor Plus 555 (für c-Fos, 1:500; A32794, Thermo Fisher Scientific, Waltham) konjugiert waren , MA, USA), Alexa Fluor 647 (für VGluT2, 1:500; 706-605-148, Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, USA), Alexa Fluor 488 (für Calbindin, 1:500; A11055, Thermo Fisher Scientific ) und Alexa Fluor Plus 405 (für NeuN, 1:500; A48257, Thermo Fisher Scientific) in 0,05 M PBS, enthaltend 10 % normales Eselserum und 0,3 % Triton X-100. Nach zwei- bis dreimaligem Waschen mit 0,1 M Phosphatpuffer wurden die Schnitte auf Objektträger aufgezogen, mit SlowFade Diamond-Antifade-Eindeckmittel (Thermo Fisher Scientific) versiegelt und mit einem Deckglas versehen. Die Bilder wurden mit einem Fluoreszenzmikroskop (BZ-X 810, Keyence, Tokio, Japan) aufgenommen. Die Anzahl der c-Fos-exprimierenden Zellen in jeder BF- und Dys-Säule wurde manuell gezählt. Die Anzahl der NeuN-gefärbten Neuronen in denselben interessierenden Regionen wurde ebenfalls gezählt. Die manuelle Zählung wurde von einem verblindeten unabhängigen Beobachter durchgeführt.

Nachdem die Gehirne nachfixiert worden waren, wurden 50 μm dicke Schnitte angefertigt und abwechselnde Schnitte mit Cytochrom-C-Oxidase zur Identifizierung von BF und mit c-Fos-Immunhistochemie umgesetzt. Für die c-Fos-Immunhistochemie wurden die Schnitte mit 1 % H2O2 in Phosphatpuffer verarbeitet, um die intrinsische Peroxidase zu deaktivieren, und dann mit Anti-c-Fos-Antikörper (1:10.000, Kaninchen; Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland) in 10 % Normal inkubiert Ziegenserum in phosphatgepufferter Kochsalzlösung mit 0,3 % Triton X-100 bei 4 °C über Nacht. Die Schnitte wurden dann mit biotinyliertem Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG-Antikörper (1:200; Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) inkubiert und mit Avidin-Biotin-Peroxidase-Komplex (ABC-Kit; Vector Laboratories) zur Reaktion gebracht. Die Schnitte wurden zur Visualisierung in DAB-Lösung (0,02 % DAB, 0,3 % Nickelammoniumsulfat in Tris-gepufferter Kochsalzlösung) und 1 % H2O2 inkubiert. Die Bilder wurden mit einem aufrechten Mikroskop mit einer CCD-Kamera (DP70; Olympus, Tokio, Japan) unter Verwendung von Olympus DP Manager (Version 3.1.1.208, Olympus) aufgenommen. Neuronen, die c-Fos exprimieren, wurden unter Verwendung eines speziell geschriebenen MATLAB-Programms (MathWorks, Natick, MA, USA) (Supplementary Software 1) mit Kantenerkennung durch einen Sobel-Filter und anschließender Binarisierung gezählt. Die Anzahl der c-Fos-exprimierenden Zellen wurde von einem verblindeten unabhängigen Beobachter manuell in drei Schnitten gezählt; Diese Person war nicht an der automatischen Zählung beteiligt und bestätigte, dass die Tendenz der c-Fos-Expression in jeder Schicht regional nicht unterschiedlich war.

Zur retrograden Markierung wurde die mit Alexa Fluor 555 (0,2 %) oder Alexa Fluor 488 (1 %) konjugierte Choleratoxin-Untereinheit B nach intrinsischer Signalbildgebung angewendet, um Dys bzw. BF zu identifizieren. Drei Tage später wurden die Mäuse mit Natriumpentobarbital (60 mg/kg Körpergewicht, intraperitoneal) tief anästhesiert und transkardial mit einer Fixierlösung (4 % Paraformaldehyd und 0,2 % Pikrinsäure in 0,1 M Phosphatpuffer) perfundiert. Die Gehirne wurden entnommen und koronal in 50 μm große Abschnitte geschnitten. Die Schnitte wurden über Nacht mit einem polyklonalen Meerschweinchen-Antikörper gegen VGluT2 (1:500; MSFR106290, Nittobo Medical Co., Ltd., Tokio, Japan) inkubiert, gefolgt von NeuroTrace 435/455 (1:100; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA).

Zur anterograden Markierung wurde biotinyliertes Dextranamin (Molekulargewicht: 10.000, 10 % in Kochsalzlösung; Thermo Fisher Scientific) in den POm injiziert (1,7 mm hinter dem Bregma und 1,3 mm seitlich der Mittellinie). Sieben Tage später wurden die Mäuse tief betäubt und die Gehirnschnitte wie oben beschrieben geschnitten. Die Schnitte wurden über Nacht mit VGluT2-Antikörper (Meerschweinchen; 1:500, MSFR106290, Nittobo Medical Co., Ltd., Tokio, Japan) inkubiert, gefolgt von Alexa Fluor 594-konjugiertem Anti-Meerschweinchen-Antikörper (1:500; 706–585). 148, Jackson ImmunoResearch), Alexa Fluor 488-konjugiertes Streptavidin (1:500; S11223, Thermo Fisher Scientific) und anschließend mit NeuroTrace 435/455 (1:100; S21479, Thermo Fisher Scientific).

Mindestens 4 Tage nach der Kopfplattenimplantation wurde eine intrinsische Signalbildgebung durchgeführt, um die Reaktionen von BF zu messen. Die Maus wurde wie oben unter „Elektrophysiologische Aufzeichnung“ beschrieben anästhesiert. Die Atemfrequenz und die Herzfrequenz wurden über einen videobasierten Atemmonitor mit einer 30-Hz-Webkamera (C920; Logitech, Lausanne, Schweiz) und einem speziell angefertigten Beschleunigungsmonitor auf dem Rücken des Tieres überwacht. Intrinsische Signalbilder wurden mit der microDisplay-Software (Version 5.2.3.1, Silicon Software GmbH, Deutschland) von einer CMOS-Kamera (MV1-D1024E-160-CL; Photonfocus, Lachen, Schweiz) mit der Tandemlinse eines achromatischen Dubletts (Thorlabs) erhalten , Newton, NJ, USA) und Langpass- und Kurzpassfilter (BLP01-488R-25 und FF01-650/SP-25; Semrock, Rochester, NY, USA). Die Bilder wurden mit einer Rate von 20 Hz aufgenommen, die Bildgröße betrug 600 × 500 Pixel und repräsentierte 5,5 × 4,5 mm des kortikalen Bereichs. Die Gehirnoberfläche wurde mit einer grünen LED (M530L3; Thorlabs) beleuchtet, um das Gefäßmuster zu erhalten, oder mit einer roten LED (M617L3; Thorlabs), um das intrinsische Signal zu erhalten. Die Leuchtdichte der roten LED war zwischen den einzelnen Aufnahmen konstant. Die Atemfrequenz (70–120 Zyklen/s) wurde überwacht, um die Narkosetiefe zu verfolgen. Die Bilder wurden durch den mit klarem Zahnacrylharz bedeckten Schädel aufgenommen. Das Dental-Acrylharz wurde mit einem Nageldecklack und Silikon-Immersionsöl (Olympus) überzogen, um Blendeffekte zu reduzieren.

Whisker-Stimulationen als taktile Reize wurden mit einem piezoelektrischen Gerät wie zuvor beschrieben68 erzeugt. Um die kortikale Reaktion auf taktile Reize zu visualisieren, haben wir das Reflexionsverhältnis in jedem Bild berechnet (dR/R, wobei dR die Differenz des Reflexionsvermögens R vom Basisbild ist, das dem Durchschnitt aus 20 Bildern entspricht, die vor Beginn des Reizes aufgenommen wurden). Um die Veränderung der kortikalen Aktivität abzubilden, wurden an verschiedenen Versuchstagen aufgenommene Bilder mithilfe eines speziell entwickelten MATLAB-Programms anhand der Gefäßmuster ausgerichtet. Für die Populationsanalyse haben wir das z-bewertete Bild aus dR/R mithilfe der folgenden Gleichung berechnet:

wobei SD die Standardabweichung ist. Die Positionen der Bregma wurden für die Ausrichtung zwischen Tieren verwendet.

Um ein neuropathisches Schmerzmodell zu erstellen, wurde das ION mit einem chirurgischen Faden (Vicryl Rapide; Ethicon, Bridgewater, NJ, USA) fest abgebunden. Mit diesem Faden können wir Veränderungen in der BF-Aktivität sowohl während einer Nervenverletzung als auch während der Genesung beobachten, da die Zugfestigkeit des Fadens im Körper allmählich abnimmt (innerhalb von 2–3 Wochen); Die Zugfestigkeit ist bei POD7 auf fast 50 % und bei POD21 auf 0 % reduziert, entsprechend den Phasen der Nervenverletzung bzw. der Erholung. Für den Verhaltenstest bei neuropathischen Schmerzen wurden die Tiere darauf trainiert, in ein 50-ml-Röhrchen mit einem speziell angefertigten Röhrchenhalter einzutreten. Das Verhaltenstraining begann, nachdem die Mäuse mindestens 7 Tage vor der linken ION-Ligation oder der Scheinoperation eingeschränkten Zugang zu Wasser (1 ml/Tag) hatten. Während des Verhaltensexperiments war die Wassermenge einen Tag lang auf 1,5 ml beschränkt. Den Tieren wurde beigebracht, in die Röhre einzudringen und ihre Schnauzen durch ein Loch herausragen zu lassen, um das Wasser zu trinken. Während die Tiere tranken, wurde das linke Schnurrbartpolster durch die von Frey-Filamente (1,4, 2, 4, 6, 8 und 10 g; Ugo Basile, Varese, Italien) stimuliert, um die Fluchtschwelle zu messen70. Während der Stimulation wurden visuelle Informationen durch eine schwarze Abdeckung blockiert (ergänzende Abbildung 6).

7 oder 21 Tage nach der ION-Ligation und 7 Tage nach der Scheinoperation wurden die Mäuse 1 Stunde lang in eine angereicherte Umgebung gebracht, um das Rühren zu verstärken, während sie mehrere Objekte erkundeten (ergänzende Abbildung 9)40,41. Anschließend wurden die Mäuse mit 4 % Paraformaldehyd mit Pikrinsäure perfundiert, gefolgt von einer c-Fos-Immunhistochemie unter Verwendung des oben beschriebenen DAB-Protokolls.

Zunächst wurde den Mäusen beigebracht, in eine Röhre zu gehen, um drei bis vier Tage lang eine Wasserbelohnung zu erhalten. Anschließend wurde der Kopf der Mäuse fixiert und sie konnten 3–4 Tage lang frei auf einem kugelförmigen Laufband (Ø 30 cm) unter weißem Rauschen71 laufen. Danach wurde das Verhalten der Mäuse gegenüber dem IR-Laserreiz auf dem linken Whisker-Pad überwacht. Für den schädlichen Hitzereiz wurde ein IR-Diodenlaser (Ø 1 mm auf dem Whisker-Pad, Wellenlänge 808 nm, SSL-808-1000-10TM-D-LED; Shanghai Sanctity Laser Technology Co., Ltd., Shanghai, China) verwendet. wurde benutzt. Die Reizdauer wurde auf 500 bzw. 1.500 ms eingestellt, entsprechend 0,09 bzw. 0,27 J/mm2, um die Hauttemperatur auf 39 °C bzw. 52 °C zu erhöhen43. Zu Beginn und am Ende jeder Sitzung erhielten die Tiere eine Wasserbelohnung auf dem Laufband, nicht jedoch während der Reizsitzungen. Jede Sitzung bestand aus verschiedenen Reizbedingungen, und jede Bedingung wurde zufällig ausgewählt und dem Tier fünfmal in einer Sitzung präsentiert. Die Tiere wurden mit drei Kameras bei 30 Hz (der IR-Filter am CMOS-Sensor wurde entfernt; C922, Logitech, Lausanne, Schweiz) hinter und neben dem Tier platziert, um Verhaltensweisen wie Fluchtrichtung, Geschwindigkeit und Bewegungsentfernung aufzuzeichnen , Augenzwinkern und Bewegung der linken Vorderbeine. Diese Parameter wurden analysiert, indem die Differenz des interessierenden Bereichs jedes Parameters Bild für Bild berechnet wurde. Diese Parameter wurden für Vergleiche zwischen den Tieren mit einem benutzerdefinierten MATLAB-Code (Supplementary Software 2) in Z-Scores umgerechnet. Wenn das Tier vor dem Einsetzen des Reizes kontinuierlich auf dem Laufband lief, wurde die Wirkung des Reizes maskiert. Diese Tiere neigten dazu, unabhängig von den Reizen ununterbrochen zu rennen. Daher konnte kein Unterschied in der Höchstgeschwindigkeit zwischen den Versuchen beobachtet werden und diese Sitzungen wurden von der Analyse ausgeschlossen. Zur Berechnung der Z-Scores wurden mindestens zwei Sitzungen verwendet. Ein Notch-Filter (808 nm OD4 Notch-Filter, 86-702; Edmund Optics) wurde vor der linken Kamera platziert, um ein Whiteout des Sensors zu verhindern und die genaue Position und Größe der IR-Laserstimulation zu identifizieren. Vor jeder Kamera wurden speziell angefertigte LED-Beleuchtungen (940 nm) angebracht, um die Tiere zu beleuchten.

Um die thalamokortikalen Fasern von POm in Dys zu aktivieren, wurde ein Virus (AAV9-hSyn-hChR2(H134R)-EYFP) in den rechten POm injiziert (1,7–1,9 mm kaudal und 1,2 mm lateral von Bregma; Tiefe: 2800 und 3000 μm). der Gehirnoberfläche; 50 nL in jeder Tiefe) (QSI; Stoelting, Wood Dale, IL, USA). Ein blauer Laser (473 nm; Lasos, Deutschland) wurde an ein Glasfaserkabel (Ø 200 μm; Thorlabs) gekoppelt. Der Ausgang der optischen Faser und die Oberfläche des Kortex wurden mithilfe eines Faseranschlusses und einer achromatischen Linse auf konjugierten Ebenen platziert. Die x- und y-Galvanospiegel (Galvano-Scansystem, GVS002; Thorlabs) wurden im Unendlichkeitsraum platziert, um die Position des Reizes zu steuern. Außerdem wurde ein dichroitischer Spiegel im Unendlichkeitsraum platziert und das reflektierte Licht auf den Sensor einer CMOS-Kamera (Grasshopper3; Teledyne FLIR, Oregon) fokussiert. Dieses Design ermöglichte die Überwachung der genauen Lage der stimulierten Stelle49.

Ein optischer Chopper (Impulsbreite 2,5 ms, MC2000B; Thorlabs) wurde verwendet, um PV-Interneuronen mit einem 40-Hz-Impuls zu aktivieren72. Um die unterdrückende Wirkung der Dys-Aktivität zu untersuchen, wurden die sechs Dys-deckenden Positionen durch einen 473-nm-Laser stimuliert, der durch eine achromatische Dublettlinse (AC254-60-A; Thorlabs) auf die Gehirnoberfläche fokussiert wurde. Die Zentren der Stimulationsstellen waren 430 µm voneinander entfernt. Die Leistung betrug 0,9 mW pro Standort und der Radius 0,5–0,75 mm, was zu 0,51–1,15 mW/mm2 mit Lichtdämpfung durch den Schädel führte50. Die Laserpositionen an beiden Enden, Position 1 (P1) und P6, waren deutlich von Dys entfernt, wohingegen P3 und P4 bei Dys zentriert waren. Aufgrund der Größe des Lichtflecks können P3 und P4 benachbarte Pfoten- und BF-Regionen teilweise stimulieren.

Die Statistiken wurden mit MATLAB (R2018a, 9.4.0.813654) durchgeführt. Sofern nicht anders angegeben, werden die Daten als Mittelwert ± SEM dargestellt. Die repräsentativen koronalen Abschnitte in Abb. 1a, Ergänzende Abbildungen. 1b, 9b, 13a, b und 14a sowie die in Abb. 4c und der ergänzenden Abb. 7 gezeigten repräsentativen Tangentialschnitte wurden unabhängig voneinander wiederholt, wobei die gleichen Ergebnisse mindestens dreimal oder mit der gleichen Anzahl von Tieren in jedem Experiment erzielt wurden.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Research Reporting Summary.

Alle Daten, die die Ergebnisse dieser Studie stützen, sind im Papier und in den Zusatzinformationen enthalten. Diesem Dokument liegt eine Quelldatendatei bei. Alle Daten sind auf Anfrage bei den Autoren erhältlich. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

Alle Computercodes, die zur Analyse oder Anzeige der Daten verwendet werden, sind auf begründete Anfrage beim jeweiligen Autor erhältlich.

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Wir danken Sachie Sekino und Yumi Tani für ihre hervorragende technische Unterstützung. Diese Forschung wurde durch die JSPS KAKENHI-Zuschussnummern JP15K21387, JP17H05912, JP18K14854, JP21K07285 und die Uehara Memorial Foundation to HO unterstützt. Diese Forschung wurde teilweise auch durch die JSPS KAKENHI-Zuschussnummern JP20H05481, JP20H05916, JP20K21508, JP17H0575 unterstützt 2, JP15H01667, und der SHISEIKAI-Stipendienfonds für Grundlagenforscher der medizinischen Wissenschaft, Keiko Watanabe-Preis an MM und JSPS KAKENHI-Stipendium mit der Nummer JP21K06444 an YU und das Programm für Brain Mapping by Integrated Neurotechnologies for Disease Studies (Brain/MINDS) der Japan Agency for Medical Research and Development, AMED, im Rahmen eines Stipendiums Nummer JP19dm0207057.

Hironobu Osaki

Aktuelle Adresse: Laboratory of Functional Brain Circuit Construction, Graduate School of Brain Science, Doshisha University, Kyotanabe, Kyoto, Japan

Abteilung für Neurophysiologie, Abteilung für Physiologie, Graduate School of Medicine, Tokyo Women's Medical University, Shinjuku, Tokio, Japan

Hironobu Osaki, Moeko Kanaya, Yoshifumi Ueta und Mariko Miyata

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HO und MM haben die Experimente entworfen. HO, MK und YU führten die Experimente durch und analysierten die Daten. HO und MM haben den Originalentwurf geschrieben.

Korrespondenz mit Hironobu Osaki oder Mariko Miyata.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Communications dankt Jochen Staiger, Oleg Favorov und den anderen anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Peer-Review-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Osaki, H., Kanaya, M., Ueta, Y. et al. Ausgeprägte Nozizeptionsverarbeitung in den dysgranulären und Barrel-Regionen des somatosensorischen Kortex der Maus. Nat Commun 13, 3622 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-31272-w

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Eingegangen: 25. März 2021

Angenommen: 07. Juni 2022

Veröffentlicht: 29. Juni 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-31272-w

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