Frequenz-Wellenlängen-Multiplex-Optoakustische Tomographie

Nature Communications Band 13, Artikelnummer: 4448 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Optoakustik (OA) wird überwiegend im Zeitbereich (TD) implementiert, um hohe Signal-Rausch-Verhältnisse durch Maximierung des Anregungslichtenergie-Transienten zu erreichen. Es wurden Implementierungen im Frequenzbereich (FD) vorgeschlagen, die jedoch unter niedrigen Signal-Rausch-Verhältnissen leiden und keine Wettbewerbsvorteile gegenüber Zeitbereichsmethoden bieten, um eine hohe Verbreitung zu erreichen. Daher wird allgemein angenommen, dass TD die optimale Methode zur Durchführung von Optoakustik ist. Hier stellen wir ein optoakustisches Konzept vor, das auf Impulsfolgenbeleuchtung und Frequenzbereichsmultiplexierung basiert, und demonstrieren theoretisch die überlegenen Vorzüge des Ansatzes im Vergleich zum Zeitbereich. Anschließend starten wir unter Nutzung der jüngsten Fortschritte in der Laserdiodenbeleuchtung die Frequency Wavelength Multiplexing Optoacoustic Tomography (FWMOT) bei mehreren Wellenlängen und demonstrieren experimentell, wie FWMOT die Signal-Rausch-Verhältnisse von Spektralmessungen über Zeitbereichsmethoden in Phantomen und anderen optimiert vivo. Wir stellen außerdem fest, dass FWMOT den schnellsten multispektralen Betrieb bietet, der jemals in der Optoakustik demonstriert wurde.

Die Erzeugung optoakustischer (OA) Signale erfordert die Beleuchtung der Probe mit Energietransienten (z. B. gepulste oder sinusförmige Beleuchtung)1. Die Probe absorbiert diese zeitveränderliche Energie und erzeugt anschließend durch thermoelastische Ausdehnung eine akustische Welle2. Time Domain (TD) OA-Implementierungen bieten große Energietransienten mithilfe von Lichtimpulsen mit einer Dauer von Nanosekunden3,4,5,6, um die für die optoakustische Signalerzeugung erforderlichen thermischen und Spannungsbegrenzungsgrenzen zu erfüllen7. Ein Impuls mit Nanosekundendauer maximiert außerdem den Energieübergang und optimiert das Signal-Rausch-Verhältnis (SNR), wodurch TD zum Bereich der Wahl in der Optoakustik wird8,9,10. Die optoakustische TD-Bildgebung erfasst die Flugzeit der erzeugten Ultraschallwellen (US) an mehreren Stellen auf der Oberfläche des untersuchten Objekts mithilfe eines empfindlichen Ultraschallwandlers und wandelt diese Messungen mithilfe mathematischer Inversion in dreidimensionale Karten von um optische Absorption11.

Andere Bildgebungsmodalitäten wie die optische Kohärenztomographie (OCT) oder die Magnetresonanztomographie (MRT) wurden ursprünglich im TD demonstriert, haben jedoch hinsichtlich der Bildgebungsgeschwindigkeit und des SNR von der Umstellung auf den Frequenzbereich (FD)12,13 profitiert . Als Alternative zu TD wurde auch die Frequenzbereichs-Optoakustik (FD) in Betracht gezogen, bei der die Beleuchtungsintensität bei einer diskreten Frequenz moduliert und die erzeugten OA-Signale bei derselben Frequenz erfasst werden14,15,16. Die Signalerkennung wird mit Demodulationstechniken erreicht, die die Amplitude und Phase des OA-Signals abrufen. Diese Technologie ist einfacher und wirtschaftlicher als die Aufzeichnung von Zeitsignalen mit Abtastraten von mehreren zehn MHz, wie es bei der TD-Erkennung üblich ist. FD kann auch eine gleichzeitige Beleuchtung bei mehreren Wellenlängen ermöglichen, indem Quellen unterschiedlicher Farbe bei unterschiedlichen Frequenzen moduliert werden17,18,19. Trotz dieser Vorteile liefert intensitätsmoduliertes Licht14,15,16 Energietransienten und entsprechende optoakustische Signale, die nur sechs Größenordnungen19 schwächer sind als die in TD verwendeten ultrakurzen Impulse, was das SNR im FD20,21,22 drastisch reduziert. Darüber hinaus gelingt es optoakustischen Untersuchungen bei einer einzelnen Frequenz nicht, Tiefeninformationen zu sammeln oder zu einer dreidimensionalen Bildgebung zu führen. Wir haben kürzlich gezeigt23, dass Tiefeninformation und dreidimensionale Bildrekonstruktion die Erzeugung von Signalen mit mehreren diskreten Frequenzen erfordern, eine Anforderung, die zu komplexen Emissions- (Modulations-) und Erkennungsschemata (Demodulations-)Schemata führt23,24. Daher hatte FD trotz der potenziellen Vorteile gegenüber TD17,18,19,23,24 nur geringe Auswirkungen auf den Bereich der Optoakustik. Frequenz-Chirp wurde auch als hybride TD-FD-Methode untersucht, bei der Licht mit einer kontinuierlich variierenden Frequenz moduliert wird17,25 und so Zeit in Frequenz kodiert. Die Detektion erfolgt im TD mithilfe von Zeitkorrelationstechniken. Ähnlich wie bei FD-Methoden begrenzt jedoch die Verwendung von Sinuswellen das erreichte SNR, wodurch die Verwendung von Chirp-Ansätzen auf experimentelle Untersuchungen beschränkt wird.

Hier schlagen wir einen Frequenz-Wellenlängen-Multiplexbetrieb (FWM) vor, um die TD-Leistung deutlich zu verbessern und gleichzeitig die FD-Nachteile zu minimieren. FWM ist praktisch die umgekehrte Implementierung der Chirp-Optoakustik, bei der eine Folge diskreter Impulse verwendet wird, ähnlich denen, die in der TD-Optoakustik verwendet werden, aber die resultierenden diskreten Frequenzen verarbeitet werden, die im FD23 erscheinen, eine Reaktion, die dem in gezeigten Frequenzkamm-Erscheinungsbild analog ist Spektralfrequenzen. Wie hier gezeigt, ermöglicht die FWM-Beleuchtung auch die gleichzeitige Beleuchtung bei mehreren Wellenlängen, ohne die Bildgebungszeit zu verlängern, und führt zu einem SNR-Gewinn, der im Vergleich zu TD-Systemen um die Quadratwurzel der Anzahl der verwendeten Wellenlängen N zunimmt. Nach theoretischen Überlegungen stellten wir die Hypothese auf, dass übersteuerte Laserdioden26, die eine günstigere und praktischere Alternative zu Festkörperlasern darstellen, FWM-Pulszüge nutzen und zu einer hochwertigen optoakustischen Bildgebung führen könnten, die Vorteile gegenüber TD-Implementierungen aufweisen könnte. Wir stellen ein Frequenz-Wellenlängen-Multiplex-optoakustisches Tomographiesystem (FWMOT) vor, das vier gleichzeitig gepulste übersteuerte Laserdioden verwendet, von denen jede eine leicht unterschiedliche Wiederholungsrate verwendet, um unterschiedliche Wellenlängen zu kodieren. Diese Wellenlängen erscheinen dann bei unterschiedlichen diskreten Frequenzen im Frequenzbereich. Wir zeigen die gleichzeitige mesoskopische27 Multiwellenlängen-Bildgebung der lymphatischen und mikrovaskulären Dynamik bei Mäusen bei hohen SNRs. Dies bietet die schnellste Multiwellenlängenbeleuchtung, die jemals auf dem Gebiet der Optoakustik erreicht wurde, und bestätigt die spektrale Leistung, die sich gegenüber TD-Implementierungen verbessert.

Im herkömmlichen TD-Betrieb ergibt ein quadratischer Lichtimpuls der Dauer tp (Abb. 1a) über die Fourier-Transformation ein kontinuierliches Frequenzspektrum im FD, wobei der erste Knoten bei der Frequenz 1/tp liegt. Im FD-Betrieb erzeugt Licht, das im TD durch eine Sinuswelle moduliert wird (Abb. 1b), eine einzelne diskrete Frequenz im FD. Bei der Frequenz-Wellenlängen-Multiplexmodulation wird stattdessen eine Folge von Impulsen (Abb. 1c) mit einer Impulsbreite von tp und einer Wiederholungsrate frep berücksichtigt. Die Fourier-Transformation dieser Impulsfolge ergibt viele diskrete Frequenzen mit einer Hüllkurve (Abb. 1c, rechts), die mit dem kontinuierlichen Spektrum eines einzelnen Impulses mit der Dauer tp (Abb. 1a, rechts) identisch ist. Die diskreten Frequenzen der Impulsfolge sind Harmonische der Grundwiederholungsrate frep, also ganzzahlige Vielfache von frep. Eine höhere Wiederholungsrate erhöht die Anzahl der Impulse im TD und reduziert die diskreten Spitzen im FD (Abb. 1d). Beim FD führt eine längere Impulsbreite dazu, dass der erste Knoten (bei 1/tp) bei niedrigeren Frequenzen erscheint (Abb. 1e), verringert die Gesamtenergiedichte bei höheren Frequenzen und verringert die räumliche Auflösung28.

a Ein einzelner Anregungslichtimpuls der Dauer tp in TD (links) und ein kontinuierliches Frequenzspektrum in FD (rechts). b Eine Sinuswelle der Frequenz f in TD und FD, eine kontinuierliche Welle in TD und eine einzelne diskrete Spitze in FD. c Eine Folge von Impulsen mit der Impulsdauer tp und der Wiederholungsrate frep in TD und FD. Viele diskrete Impulse in TD und viele diskrete Frequenzen in FD mit derselben Hüllkurve wie ein einzelner Impuls der Dauer tp in a. d Eine Folge von Impulsen mit der Impulsdauer tp und der Wiederholungsrate 2frep in TD und FD. Doppelt so viele Impulse in TD, aber halb so viele diskrete Frequenzen in FD im Vergleich zu c. e Eine Folge von Impulsen mit einer Impulsdauer von 2tp und einer Wiederholungsrate von 2frep in TD und FD. Ebenso viele Impulse in TD und diskrete Frequenzen in FD wie in d, aber jetzt einer anderen Hüllkurve folgend als (a) oder (c). f Das optoakustische Rohsignal, das mit einer Impulsfolge wie (c) aufgezeichnet wurde, zum Beispiel mit 1, 2, 3 und …, die die verschiedenen Perioden angeben. g, h stellen die normale Mittelung in TD dar. g Die Impulsfolge ist in Abschnitte mit der Periode T = 1/frep aufgeteilt, angezeigt durch 1, 2, 3 und …, die Punkt für Punkt gemittelt (h) werden. i, j Die Frequenz-Wellenlängen-Multiplexverarbeitung desselben Signals. i Die Fourier-Transformation des rohen optoakustischen Signals (f) mit vielen diskreten Frequenzen, die alle Harmonische (k * frep mit k positiver Ganzzahl) der Basiswiederholungsrate frep sind. In FD wählen wir nur die Harmonischen von frep und verwerfen alle anderen Frequenzen, die nur Rauschen enthalten (j). k Indem wir die inverse Fourier-Transformation in j durchführen, stellen wir das TD-Signal wieder her, das perfekt mit dem in h übereinstimmt.

Die experimentelle Validierung des FWM-Schemas wurde durchgeführt, indem eine schwarze Lackschicht auf einer Petrischale nur mit L1 angeregt wurde (Abb. 1f, g). Die Mittelung in TD (Abb. 1g, h) erhöht das SNR um den Faktor \(\scriptstyle{\sqrt{{N}_{{{{{\rm{p}}}}}}}}\), wobei Np ist die Anzahl der Impulse in der Impulsfolge. Im Gegensatz dazu wählt die vorgeschlagene FWM-Methode die Grundfrequenz frep und ihre Harmonischen k * frep aus, wobei k eine ganze Zahl ist (Abb. 1i), indem die folgende Operation ausgeführt wird (siehe Ergänzende Anmerkung 1):

Dabei ist Sa (ω) die Fourier-Transformation des gemittelten Signals, Sr (ω) die Fourier-Transformation des aufgezeichneten Signals (Abb. 1f), Nh die Anzahl der Harmonischen in der erfassten Ultraschallwandlerbandbreite und ω0 = 2π/T. Das OA-Signal wird mit genau den gleichen Frequenzen erzeugt, die die Anregungs-LD-Pulsfolge enthält. Daher wählt Operation (1) nur die Harmonischen von frep aus und filtert Frequenzen heraus, die kein Signal enthalten, um das SNR um denselben Faktor zu erhöhen \(\scriptstyle{\sqrt{{N}_{{{{{\rm{p }}}}}}}}\) wie im TD (Abb. 1j). Das Signal in Abb. 1j ist die Fourier-Transformation des Signals in Abb. 1h, wobei die beiden Signale perfekt übereinstimmen (Abb. 1k). Diese Analyse bestätigt, dass die FWM-Beleuchtung zu einer praktischen Erzeugung mehrerer diskreter Frequenzen führt, die für einen genauen FD-Betrieb erforderlich sind, und ein SNR bietet, das dem TD entspricht, wenn eine einzelne Wellenlänge verwendet wird. Die FWM-Analyse ist daher das Fourier-Raum-Äquivalent zur normalen Zeitmittelung. Als nächstes zeigen wir jedoch, dass FWM Vorteile gegenüber TD bietet, wenn mehrere Wellenlängen verwendet werden.

Um den FWM-Vorteil gegenüber dem TD zu demonstrieren (Abb. 2), haben wir das Einzelwellenlängen-Anregungsmuster im TD und sein Leistungsspektrum im Fourier-Raum (Abb. 2a) aufgezeichnet, um als Referenz für die folgende Analyse zu dienen. Der gezeigte Impulszug hat eine Periode T, die einer Wiederholungsrate frep = 1/T entspricht, eine Gesamtzahl von Impulsen Np, eine Impulsbreite tp und eine Erfassungszeit tacq = Np × T. Die Periode T definiert die maximale Tiefe von -view DoV = vs × T, die für die ausgewählte Impulsfolge erreicht werden kann, wobei vs die Schallgeschwindigkeit ist.

a Ein Impulszug einer Wellenlänge mit der Periode T und der Wiederholungsrate frep = 1/T, mit Np-Impulsen und der Erfassungszeit tacq im Zeitbereich (TD, links) und im Fourier-Bereich (rechts), wobei k frep die Harmonischen von frep mit k ist eine Ganzzahl. b–d Mehrfachwellenlängenanregung in TD Optoacoustic (OA). b Das Anregungsmuster von 4 Wellenlängen, die mit der gleichen Wiederholungsrate frep mit einer Zeitverschiebung von T/4, Np-Impulsen für alle Wellenlängen und tacq-Erfassungszeit emittieren. c Das Anregungsmuster von 4 Wellenlängen mit frep/4-Wiederholungsrate, Np/4-Impulsen für jede Wellenlänge und Tacq-Erfassungszeit. d Das Anregungsmuster von vier Wellenlängen mit einer Wiederholungsrate von frep/4, Np-Impulsen pro Wellenlänge, aber einer Erfassungszeit von 4tacq. e FWMOT-Anregung, bei der alle vier Wellenlängen unterschiedliche Wiederholungsraten frep,1, frep,2, frep,3, frep,4, Np-Impulse für jede Wellenlänge und Tacq-Erfassungszeit haben. f–j Das OA-Signal, das von einer schwarzen Lackschicht auf einer Petrischale aus den Anregungsmustern in (a–e) aufgezeichnet wurde. Für alle Fälle sind das Signal-Rausch-Verhältnis (SNR) und der Rauschpegel eingefügt. f α, die elektromagnetische Interferenz der Laserdiodenschaltung bei Auslösung, β das OA-Signal vom schwarzen Lack, γ die Reflexion des OA-Signals in der Petrischale oder in der akustischen Linse des Ultraschallwandlers. g Das OA-Signal des Anregungsmusters b für alle Wellenlängen (obere Zeile) ist die Summe des OA-Signals jeder Wellenlänge (untere Zeile) mit drastisch reduzierter Sichttiefe (DoV) für jede Wellenlänge. Die Laserinterferenz, das OA-Signal und seine Reflexionen (α, β, γ) für jede Wellenlänge werden angezeigt. h Das OA-Signal weist bei jeder Wellenlänge ein verringertes SNR auf. i Das OA-Signal hat das gleiche SNR, jedoch mit längerer Erfassungszeit. j Das Signal aller vier Wellenlängen wurde ohne Übersprechen zwischen den Lasern wiederhergestellt und rechtzeitig korrekt registriert, ohne dass DoV, SNR oder Erfassungszeit beeinträchtigt wurden. Blau, Rot, Orange, Lila und Grün werden verwendet, um Laser 1, Laser 2, Laser 3 bzw. Laser 4 anzuzeigen.

TD-Wellenlängenmultiplexing wird mithilfe von Wellenlängenverschachtelung oder Time-Sharing durchgeführt. Wenn jedoch die Anzahl der Wellenlängen im TD erhöht wird, muss mindestens einer der folgenden drei Parameter beeinträchtigt werden: der DoV, die Anzahl der Impulse in der Impulsfolge und damit das SNR für jede Wellenlänge oder die Gesamterfassungszeit. Abbildung 2b zeigt, wie der DoV reduziert wird, wenn vier Wellenlängen bei einer gegebenen Gesamterfassungszeit verwendet werden. Die verschiedenen Wellenlängen erregen das Gewebe mit der gleichen Wiederholungsrate frep, jedoch mit einer Zeitverschiebung tsh zwischen den einzelnen Wellenlängen (Abb. 2a), gegeben durch tsh = T/N, wobei N die Anzahl der Wellenlängen ist. Das Ergebnis ist eine Verkürzung der Zeit zwischen aufeinanderfolgenden Impulsen, wodurch der für jede Wellenlänge verfügbare DoV um einen Faktor N begrenzt wird. Alternativ ist es möglich, den ursprünglichen DoV beizubehalten, indem die Wiederholungsrate für jede Wellenlänge j auf frep,j = gesenkt wird frep/N und die Anzahl der Impulse pro Wellenlänge zu Np/N (Abb. 2c); Dieser Ansatz führt jedoch zu einer SNR-Reduzierung um den Faktor \(\sqrt{N}.\) Eine dritte Alternative behält die ursprüngliche DoV und das SNR bei und verlängert gleichzeitig die Erfassungszeit um den Faktor N (Abb. 2d).

Im Gegensatz zu TD verwendet FWMOT eine kleine Frequenzverschiebung δf für die Wiederholungsrate jeder Wellenlänge (Abb. 2e; Zeit), wobei δf << frep. Jede Wellenlänge hat eine andere Wiederholungsrate, was zu einer leicht unterschiedlichen effektiven DoV führt; Da jedoch δf << frep ist, ist dieser Unterschied unbedeutend. Das Leistungsspektrum des FWMOT-Anregungsmusters (Abb. 2e; rechts) zeigt das Auftreten von Harmonischen aus der Grundwiederholungsrate für jede Wellenlänge. Die Wiederholungsrate des ersten Lasers, frep,1, kann als Referenzwiederholungsrate ausgewählt werden, wobei die Wiederholungsrate der übrigen Laser durch frep,j = frep,1 + (j − 1) * δf gegeben ist. FWMOT stellt somit die OA-Signale durch Auswertung von Gleichung wieder her. (1) mit dem entsprechenden ω0 = 2πfrep,j für jede Wellenlänge. Folglich kann FWMOT mithilfe der Frequenztrennung verschiedene Wellenlängen multiplexen, ohne die DoV, das SNR oder die Erfassungszeit zu beeinträchtigen. Bei der Signalverarbeitung im FD ist die Frequenzauflösung durch df = 1/tacq definiert, wobei tacq = Np/frep,1, was bedeutet, dass Frequenzen, die sich um weniger als df unterscheiden, nicht aufgelöst werden können. Um das OA-Signal aller Wellenlängen wiederherzustellen, sollten daher alle Harmonischen aller Laser, die in der Erkennungsbandbreite des Ultraschallwandlers (UST) liegen, einen Abstand haben, der größer als die Frequenzauflösung df ist, was eine Mindestanzahl von Impulsen Np,min erfordert hängt von den UST-Bandbreitengrenzen (Fluss und fhigh), N und frep,1 ab (siehe Ergänzende Anmerkung 2). Die Parameter N, Fluss, fhigh, frep,1 und die gewählte Anzahl von Impulsen Np definieren den Bereich kleiner Frequenzverschiebungen (δf) zwischen δfmin und δfmax, die erforderlich sind, um das Signal jeder Wellenlänge ohne Verluste wiederherzustellen. Ein δf-Wert größer als δfmin stellt sicher, dass Harmonische von Laser j und j + 1, die am unteren Ende der UST-Bandbreite liegen, gut aufgelöst werden, während ein δf-Wert kleiner als δfmax dafür sorgt, dass Harmonische von Laser 1 und N, die liegen, gut aufgelöst werden am oberen Ende der UST-Bandbreite, werden gut aufgelöst.

Um die Vorteile des FWM-Betriebs bei der Anregung mit mehreren Wellenlängen im Vergleich zur TD-Optoakustik experimentell zu demonstrieren, verwendeten wir FWMOT mit allen vier Wellenlängen. Das resultierende optoakustische Signal bei Wellenlänge 1, frep,1 = 200 kHz und Np = 200 ist in Abb. 2f dargestellt und erreicht tacq = 1 ms und DoV = 7,5 mm. Elektromagnetische Störungen durch die Treiberschaltung der Laserdiode (LD) werden mit α angezeigt. Das primäre OA-Signal, das von schwarzem Lack auf einer Petrischale erzeugt wird, wird mit β angezeigt, während Reflexionen von der UST-Glaslinse, die zeitlich später eintreffen, mit γ angezeigt werden. Der Einschub „Geräuschpegel“ zeigt eine separate Messung des Geräuschpegels, die eine Standardabweichung von 90,6 μV ergab. Die Intensität des OA-Signals von LD1 wurde mit 12 mV gemessen, was zu einem SNR von 21,2 dB führte.

Abbildung 2g zeigt das gemittelte OA-Signal im TD, wenn der DoV beeinträchtigt ist. Jede LD hat frep,j = 200 KHz, Np = 200 und eine Zeitverschiebung untereinander, die zu DoV = 1,875 mm und tacq = 1 ms führt. Das OA-Signal, das sich aus der gleichzeitigen Anregung unter Verwendung des Musters in Abb. 2b ergibt, wird als grüne Linie dargestellt und ist die Summe der einzelnen OA-Signale, die erhalten wurden, als jede Wellenlänge separat gepulst wurde (Abb. 2g). Wir konnten die Laser-Trigger-Interferenz für alle Wellenlängen (α) leicht erkennen. Die OA-Signale der Wellenlängen 1 und 2 (β) liegen sehr nahe an der Laserinterferenz (α) der Wellenlängen 3 bzw. 4, was ihr SNR erheblich reduziert (5,7 dB für Wellenlänge 1). Das OA-Signal der Wellenlänge 3 wird jedoch durch die Interferenz der Wellenlänge 1 vollständig maskiert. Die Reflexionen des OA-Signals der Wellenlängen 1, 2 und 3 (γ) sind weiterhin sichtbar. Daher begrenzen elektromagnetische Interferenzen und OA-Reflexionen den DoV und das SNR, die in der TD-Optoakustik mit mehreren Wellenlängen erreicht werden, weiter.

Ebenso werden SNR-Grenzwerte festgelegt (Abb. 2h) als Reaktion auf ein Anregungsmuster (Abb. 2c), das frep,j = 50 kHz, Np = 50 und DoV = 7,5 mm für jede Wellenlänge mit tacq = 1 ms verwendet. Für alle Wellenlängen haben wir beobachtet, dass die Laserinterferenz (α), das OA-Signal (β) und die Reflexionen (γ) alle sichtbar sind, jedoch mit einem geringeren SNR. In diesem Fall betrug die Rauschstandardabweichung (dargestellt in den Einschüben der Abbildung) 161,6 μV, was höher ist als die 90,6 μV, die in der Impulsfolge mit 200 gemittelten Impulsen gemessen wurden (Abb. 2f), während die resultierende Signalintensität bei 12 mV blieb in einem SNR von 18,8 dB für Wellenlänge 1. Schließlich kann mit frep,j = 50 kHz, Np = 200 und DoV = 7,5 mm für jeden Laser das OA-Signal aller 4 Laser ohne SNR-Verluste aufgezeichnet werden (N = 90,6). μV und S = 12 mV mit 21,2 dB für Wellenlänge 1), jedoch mit einer längeren Erfassungszeit, tacq = 4 ms, die in Abb. 2i dargestellt ist.

Umgekehrt verwendet der FWMOT-Betrieb für vier Wellenlängen frep,1 = 200 kHz, δf = 125 Hz und Np = 200 und stellt jedes Signal ohne Übersprechen zwischen den Wellenlängen wieder her (Abb. 2j), was theoretische Vorhersagen experimentell bestätigt. Ergänzende Abbildungen. In den Abbildungen 4 und 5 sind die Laserdioden-Anregungszeitreihen, die entsprechenden OA-Signalzeitreihen und die Leistungsspektren beider dargestellt, um die Funktionsweise von FWMOT weiter zu veranschaulichen und die Fähigkeit der Methode zu überprüfen, jedes Signal ohne Übersprechen wiederherzustellen (siehe Ergänzende Anmerkung 3). . FWMOT ist in der Lage, ein hohes SNR für die gleichzeitige Anregung mit mehreren Wellenlängen bereitzustellen, ohne die Erfassungszeit (1 ms) zu verlängern und den gleichen DoV (7,5 mm) und SNR (hier wiederum N = 90,6 μV und S = 12 mV) zu erreichen, was zu einer … SNR von 21,2 dB für Wellenlänge 1).

Wir würden einen SNR-Anstieg von 3 dB erwarten, wenn die Anzahl der gemittelten Messungen von 50 auf 200 erhöht würde. Wir haben jedoch einen SNR-Anstieg von 2,3 dB sowohl für die TD-Mittelung als auch für FWM gemessen. Diese Diskrepanz kann auf das Vorhandensein systematischen elektromagnetischen Rauschens im System zurückgeführt werden, das ebenfalls gemittelt wird und das SNR um 0,7 dB reduziert. Dieser Effekt ist jedoch ein allgemeines Merkmal des OA-Systems und kein Nachteil des FWM-Algorithmus.

Wir verglichen auch das SNR, das bei konventioneller FD-Optoakustik erzielt wurde, mit FWMOT, indem wir dasselbe schwarze Lackphantom und eine Einzelwellenlängenbeleuchtung bei 445 nm verwendeten (siehe ergänzende Abbildung 1). Die FD-Optoakustik verwendete eine Sinuswelle mit einer Frequenz von 20 MHz und einer angepassten mittleren Leistung, um der mittleren Leistungsabgabe des FWMOT-Pulsmusters zu entsprechen, das für 6,8-ns-Pulse bei 200 kHz verwendet wird. FWMOT zeigte ein um 20,8 dB höheres SNR im Vergleich zur FD-Anregung.

Während die theoretischen Vorzüge des optoakustischen FWM-Betriebs anhand von Phantommessungen demonstriert wurden, bestand ein nächster entscheidender Schritt darin, zu untersuchen, ob FWM realistische Implementierungen bieten kann. Aus diesem Grund wollten wir untersuchen, ob die theoretischen Vorteile zu Betriebseigenschaften (SNR, Erfassungsgeschwindigkeit) führen könnten, die FWMOT für In-vivo-Anwendungen geeignet machen würden. Ein besonderer unbekannter Parameter bei dieser Befragung war die FWMOT-Leistung, die mit mehreren Wellenlängen unter Verwendung von Laserdioden erreicht wurde, da es aus Kosten- und Größengründen unpraktisch wäre, FWMOT mit mehreren Festkörperlasern zu implementieren. Um die Vorteile des Einsatzes kostengünstiger Technologie zu untersuchen, untersuchten wir die Leistung mehrerer Laserdioden zur Abbildung von Gefäßen und Lymphgefäßen in vivo, wobei wir das Mausohr als Modell verwendeten. Dieses Bildgebungsziel wurde ausgewählt, da es sich um ein typisches Gewebe handelt, an dem optoakustische TD-Implementierungen herkömmlicherweise demonstriert wurden.

Zunächst haben wir beurteilt, ob FWMOT qualitativ hochwertige Bilder von biologischen Proben erzeugen kann. Wir verwendeten FWM-Beleuchtung bei 445 nm und 465 nm und lösten Oxy- und Desoxy-Hämoglobin (Abb. 3a, b) basierend auf ihrem spektralen Unterschied auf, wobei desoxygeniertes Hämoglobin bei 445 nm stärker absorbierte und umgekehrt. Die Daten wurden auf einem Raster gesammelt und zunächst mit dem FWM-Algorithmus Punkt für Punkt gemittelt, bevor sie in den Rekonstruktionsalgorithmus eingespeist wurden (siehe Methoden). Die Überlagerung von Abb. 3a, b ergab ein farbcodiertes zusammengesetztes Bild (Abb. 3c) der relativen Gefäßoxygenierung, wobei die rote Farbe höheren Oxygenierungsniveaus entspricht. Wir haben außerdem bestätigt, dass FWMOT tiefenaufgelöste Bilder (siehe ergänzende Abbildung 2) ohne Übersprechen zwischen den Wellenlängen erzeugen kann, was einen ersten Beweis dafür liefert, dass FWMOT Bilder von biologischen Geweben auf der Grundlage von LDs erfassen kann.

a und b Ein Mausohr bei den beiden blauen Wellenlängen 445 bzw. 465 nm mit hoher räumlicher Auflösung. c Das zusammengesetzte Bild ist farblich mit Rot gekennzeichnet, was auf einen höheren Sauerstoffgehalt im Vergleich zu Grün hinweist. d, e, f, g Ein zweites Mausohr bei allen vier Wellenlängen. h Ein Hellfeldbild des Mausohrs. Auf den Bildern (f, g, h) sind intradermale Injektionsstellen von Evans Blue und ICG zu erkennen. f, g Die injizierten Farbstoffe gelangen in die Lymphgefäße, die eine andere Struktur aufweisen als Blutgefäße. i Das zusammengesetzte Bild aller vier Wellenlängen. Wir können sauerstoffhaltige (rot), sauerstoffarme (grün) Blutgefäße und Lymphgefäße nach gleichzeitiger Aufnahme von Evans Blau (Cyan) und ICG (Lila) beobachten. Diese Experimente wurden zehnmal unabhängig voneinander mit ähnlichen Ergebnissen wiederholt. Bei allen Bildern handelt es sich um Maximalamplitudenprojektionen rekonstruierter Bilder. Grün ist 445 nm, Rot ist 465 nm, Cyan ist 638 nm, Lila ist 808 nm, Maßstabsleiste 1 mm.

Als nächstes wollten wir herausfinden, ob FWMOT mehrere Einheiten im Gewebe sichtbar machen kann, ohne die Betriebseigenschaften wie beim TD zu beeinträchtigen. Wir führten exogenen Kontrast durch intradermale Injektion von Evans Blau und Indocyaningrün (ICG) ein und wendeten 4-Wellenlängen-FWMOT an, um gleichzeitig Arterien und Venen (Abb. 3d, e) sowie Lymphgefäße aufzulösen, die durch Kontrastverstärkung sichtbar gemacht wurden (Abb. 3f, g). Abbildung 3h zeigt das entsprechende Hellfeldbild des Mausohrs. Das zusammengesetzte Bild aus vier Wellenlängen (Abb. 3i) ermöglichte die Visualisierung und Co-Lokalisierung der Gefäß- und Lymphgefäße. Insbesondere ermöglichte die Verwendung eines Ultrabreitbandwandlers die Auflösung der feinen Strukturen der Gefäße sowie der großen absorbierenden Bereiche, die sich um die Injektionsstellen bildeten. FWMOT kann daher effektiv verwendet werden, um OA-Bildgebung mit mehreren Wellenlängen gleichzeitig in vivo mit einer Erfassung von ca. 30 Minuten durchzuführen, während die gleiche multispektrale Implementierung in TD ca. 2 Stunden benötigt, was eine solche Messung unpraktisch macht.

Die in Abb. 3 gezeigte FWM-Erfassungsbeschleunigung gegenüber TD weist auch auf eine FWMOT-Nutzung zur gleichzeitigen Erkennung schneller Änderungen unter Verwendung mehrerer Wellenlängen hin. Wir haben daher FWMOT eingesetzt, um Sauerstoffschwankungen im Mausohr während eines Sauerstoffstresstests in vivo zu überwachen. Abbildung 4a zeigt das zusammengesetzte OA-Bild aus zwei blauen Wellenlängen, das die sauerstoffhaltigen und sauerstoffarmen Gefäße zeigt. Wir haben eine 2-mm-Linie (Abb. 4a; blaue Box) ausgewählt, um Signale wiederholt (kontinuierlicher FWM-Betrieb) mit einer Rate von ~ 4 Hz zu erfassen. Ein B-Scan (gekennzeichnet durch den Buchstaben (i) in Abb. 4a) zeigte eine Arterie (rot) und eine Vene (grün) als Funktion der Tiefe. Die Sauerstoffprovokation erfolgte durch Abwechseln der Zusammensetzung des Atemgases von 0,8 Liter pro Minute (l/min) 100 % O2 (Abb. 4b; „O2“) bis 0,6 l/min 20 % O2 plus 0,2 l/min CO2 (Abb. 4b; „O2“). "Luft"). Abbildung 4b zeigt das Verhältnis des Signals der Wellenlänge 2 (S2) zum Signal der Wellenlänge 1 (S1) über die Zeit. Das S2/S1-Verhältnis gibt Aufschluss über die relativen Veränderungen der Sauerstoffversorgung in den Gefäßen im Laufe der Zeit. Wie erwartet wurde während des gesamten Experiments eine höhere Sauerstoffversorgung in der Arterie als in der Vene beobachtet. Die Sauerstoffzufuhr wurde während der Luftzufuhr verringert und erhöht, wenn 100 % O2 bereitgestellt wurde. Der Sauerstoffgehalt in der Arterie stieg als Reaktion auf den Wechsel von der Luft- zur O2-Versorgung schneller an als in der Vene, was die erwartete Dynamik der Sauerstoffversorgung des Gewebes offenbart.

a Die OA-Bilder im blauen Wellenlängenbereich zeigen sauerstoffhaltige (rot) und sauerstoffarme (grün) Gefäße. Wir haben kontinuierlich B-Scans des blauen Bereichs durchgeführt, der mit a und „i“ gekennzeichnet ist und einen solchen Querschnitt zeigt. Der grüne Pfeil und die Region in „i“ zeigen die ausgewählte Vene an, und der rote Pfeil und die Region zeigen die ausgewählte Arterie an. Grün ist 445 nm, Rot ist 465 nm, Maßstabsbalken 1 mm. b Die zeitlichen Änderungen des Verhältnisses zwischen der OA-Signalintensität bei Wellenlänge 2 (S2) und der Intensität bei Wellenlänge 1 (S1) während eines Sauerstoffstresstests. Die Sauerstoffsättigung ist proportional zum Verhältnis S2/S1. Die Sauerstoffsättigung ändert sich in der Arterie erwartungsgemäß schneller als in der Vene. c Die Sauerstoffextraktionsrate während desselben Experiments. d Die Signalintensität bei den Wellenlängen 3 und 4 (S3 bzw. S4) an derselben Arterie und Vene, angezeigt in a, während der intravaskulären Injektion der beiden Farbstoffe Evans Blue und ICG. In beiden Fällen nimmt die Signalintensität zunächst in der Arterie und später in der Vene zu. Diese Experimente wurden dreimal unabhängig voneinander mit ähnlichen Ergebnissen wiederholt.

Die Sauerstoffextraktionsrate (OER in Abb. 4c), ein Hinweis auf die Sauerstoffaufnahme durch Zellen, wurde als OER = (Oca − Ocv)/Oca berechnet, wobei Oca und Ocv die Sauerstoffsättigung in der zentralen Arterie bzw. Vene darstellen29 . Wir beobachteten, dass die OER kurz nach der Luftzufuhrperiode leicht abfiel, was auf eine verzögerte Reaktion der Zellsauerstoffversorgung hindeutet. Als die Sauerstoffversorgung während der zweiten und dritten O2-Versorgungsperiode erhöht wurde, wurde ein erhöhter OER beobachtet, gefolgt von einer Rückkehr zu normalen Werten, was darauf hindeutet, dass die Zellen mehr Sauerstoff verbrauchten, als dieser verfügbar wurde. Das Sauerstoff-Stresstest-Experiment bestätigt, dass FWMOT eine Methode ist, die zur Untersuchung der Gewebedynamik mit hoher Lokalisierungsfähigkeit eingesetzt werden kann, bestätigt durch intravenöse Injektion von ICG und Evans Blue. Unter Verwendung desselben 2-mm-Beobachtungsfelds zeichnete FWMOT die Kontrastmitteldynamik bei 638 und 808 nm auf (Abb. 4d). Wir beobachteten ein ähnliches Post-Injektionsmuster für beide Farbstoffe, das zwei charakteristische Peaks zeigte, bevor es sich auf einen Basiswert einpendelte, der auf die Zirkulationsdynamik der Farbstoffe im Gefäßsystem hinweist. Wir haben das verzögerte Auftreten der Wirkstoffe in der Vene für beide Farbstoffe weiter gelöst, wodurch das beobachtete Signal im Vergleich zur Arterie langsamer zunahm, ein Muster, das auf die Farbstoffdiffusion im Gewebekapillarnetzwerk zurückzuführen ist.

Wir stellen eine optoakustische Methode vor, die auf Frequenzmultiplexing basiert und die vorherrschende Vorstellung in Frage stellt, dass TD-Implementierungen die beste optoakustische Leistung bieten. Durch die Kombination der Vorteile der TD-Anregung, also der gepulsten Anregung, mit der FD-Analyse bietet FWMOT eine überlegene Leistung gegenüber TD oder FD bei Anregung mit mehreren Wellenlängen. Eine Erhöhung der Anzahl der Wellenlängen (N) im TD beeinträchtigt die Sichttiefe, das SNR oder die Gesamterfassungszeit. FWMOT kann eine gleichzeitige Beleuchtung bei mehreren Wellenlängen ermöglichen, ohne einen dieser Parameter zu opfern, was entweder ein um den Faktor \(\sqrt{N}\) höheres SNR pro Wellenlänge, eine um den Faktor N kürzere Erfassungszeit oder eine N-mal größere Tiefe ermöglicht -Sichtfeld pro Wellenlänge im Vergleich zu TDOA. Darüber hinaus führt die Verwendung von Impulszügen zu praktischen FWMOT-Implementierungen, indem sie die notwendigen diskreten Frequenzen im Frequenzbereich bereitstellen und gleichzeitig die Erzeugung von FD-Signalen durch direkten Betrieb im Frequenzbereich unter Verwendung aufwändiger Mehrfrequenzmodulationssysteme vermeiden.

Ein weiterer entscheidender Aspekt bestand darin, nicht nur die theoretische Überlegenheit der Methode aufzuzeigen, sondern auch zu zeigen, dass sie zu praktischen Umsetzungen führen kann. Eine Technologie, die eine solche Leistung ermöglichte, war der Einsatz von übersteuerten Dauerstrichlaserdioden (CW-LD)26, die von Natur aus kostengünstig, tragbar und kompakt sind und zu Systemen mit dem Potenzial einer hohen Verbreitung führen. LDs sind ideal für FWMOT geeignet und können als Ersatz für Festkörperlaser eingesetzt werden. Neben ihrem kleinen Formfaktor und ihrer Verfügbarkeit bei mehreren Wellenlängen können LDs mit sehr hohen Pulswiederholungsraten gepulst werden, was der einzigartig optimalen FWMOT-Fähigkeit zum Multiplexen und Mitteln von Signalen entspricht und das SNR erhöht. Neue und leistungsstärkere LDs, die auf den Markt kommen, werden zu weiteren Verbesserungen der FWMOT-Leistung beitragen und kompakte und kostengünstige Systeme mit hohem Verbreitungspotenzial für verschiedene Anwendungen bieten9,27.

Die Bildgebung bei vier Wellenlängen differenzierte in vivo das Blutgefäßsystem von den Lymphgefäßen und reduzierte die Aufnahmezeit von 2 Stunden bei TD auf etwa 30 Minuten. FWMOT erreichte außerdem eine viermal höhere Erfassungsrate im Vergleich zu TD bei der Durchführung von B-Scans über der Hauptarterie und -vene, was die Überwachung relativer Änderungen der Sauerstoffversorgung und die Berechnung der Sauerstoffextraktionsrate ermöglichte. Daher eignet sich FWMOT besonders für dynamische Messungen oder für Experimente, die eine Anästhesie erfordern, und verbessert auch die damit verbundene Durchsatzrate gegenüber TD-Implementierungen.

Es gibt auch eine Grenze für die maximale Anzahl der in FWMOT verwendeten Wellenlängen, die von der UST-Erkennungsbandbreite, der Erfassungszeit oder der Anzahl der Mittelungen in den Impulsfolgen und der jeweils verwendeten Wiederholungsrate von L1 abhängt. Bei frep,1 = 200 kHz, Np = 100 und der UST-Bandbreite zwischen 22 und 78 MHz beträgt die maximale Anzahl von Wellenlängen 28 für FWMOT im Vergleich zu nur 5 für TD-Implementierungen mit denselben Betriebsparametern und einem DoV von 1,5 mm pro Wellenlänge (siehe Ergänzende Anmerkung 4). Je mehr Wellenlängen bei FWMOT verwendet werden, desto größer ist der SNR-Anstieg pro Wellenlänge im Vergleich zu TDOA. Die Verwendung vieler gleichzeitiger Wellenlängen wäre besonders attraktiv für die Verbesserung der molekularen Detektionsspezifität der OA-Spektroskopie.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass FWMOT eine schnelle Bildgebung mit hohem SNR unter Verwendung mehrerer Wellenlängen gleichzeitig ohne Beeinträchtigung des DoV ermöglicht und ein wertvolles Werkzeug für die Untersuchung dynamischer molekularer Prozesse bieten kann, wodurch die Art und Weise, wie die multispektrale OA-Bildgebung in Zukunft durchgeführt wird, revolutioniert wird.

Abbildung 5 zeigt das multispektrale optoakustische Rastermesoskopiesystem (RSOM), das entwickelt wurde, um die Vorteile von FWMOT zu testen. Matlab (Matlab 2016b, Mathworks, USA) wurde auf einem PC installiert und steuerte das System (Abb. 5a). Der PC steuert den Zweikanal-Stufentreiber (C-867.260, Physik Instrumente, Deutschland), der die auf dem Scankopf platzierten zwei x-y-Stufen antreibt (Abb. 5c) und mit zwei Arbiträrwellenformgeneratoren (AWG, 33522B, Keysight, USA). Die AWGs lösen die Laserdiodentreiber aus und liefern einen Synchronisationsimpuls an die Datenerfassungskarte (DAQ, 12 Bit, 200 MS/s, Razor Express 14x2 Compuscope, Dynamic Signals LLC, USA) zur synchronen Erfassung des Signals. Die Lichtausgabe des Beleuchtungssystems wird in den Scankopf geleitet, wobei ein kleiner Teil in eine Fotodiode (DET10A2/M, Thorlabs, USA) gelangt. Das Signal von der Fotodiode wird analog gefiltert (BLP-90+, MiniCircuits, USA) und aufgezeichnet, um die Puls-zu-Puls-Energieschwankungen und den Zeitjitter zu überwachen und beides während der Signalnachbearbeitung zu korrigieren. Das OA-Signal vom UST wird mit einem Verstärker mit 60 dB Verstärkung (Miteq AU-1291-R, Miteq, USA) verstärkt und analog gefiltert (BLP-90+ und ZFHP-1R2-S+, MiniCircuits, USA), bevor es vom DAQ digitalisiert wird um Aliasing zu vermeiden.

a Das Schema des entwickelten Systems zeigt die elektrischen und optischen Verbindungen der verschiedenen Teile des Systems. b Das Laserdioden-Beleuchtungssystem. Jede Laserdiode ist an einen separaten Laserdiodentreiber angeschlossen und wird mit einem 2-Linsen-System in eine Multimode-Faser fokussiert. Die vier Laserdioden sind in einem 4 × 4-Faser-Leistungskombinator gekoppelt und jeder Ausgang des Kombinators hat etwa 25 % der Leistung jedes Eingangs, wodurch alle Wellenlängen kombiniert werden. c Der Abtastkopf des RSOM-Systems, bestehend aus den x-y-Abtasttischen (i), dem 3D-gedruckten Halter (ii), dem Ultraschallwandler (iii) und den vier Ausgangsfasern des Faser-Leistungskombinierers (iv), angeordnet in a kreisförmiges Muster um den UST. Bildbestandteile mit Genehmigung der Urheberrechtsinhaber angepasst; Die optomechanischen Komponenten in b stammen von Thorlabs Inc. und die Scanning-Tische (U-723 XY) in c von der Physik Instrumente GmbH (https://www.physikinstrumente.com/de/produkte/xy-stages/u-723- piline-xy-stage-1000583/#downloads).

Das Beleuchtungssystem (Abb. 5b) besteht aus vier CW-Laserdioden, die mit vier zuvor entwickelten Hochstrom-Kurzpuls-Laserdiodentreibern übersteuert wurden26. Kurz gesagt, der Spitzenstrom der LDs wird kurzzeitig (für Nanosekunden) auf das >40-fache ihres absoluten CW-Maximums erhöht, wodurch die LDs eine bis zu 27-fach höhere Spitzenleistung als die vom Hersteller angegebene absolute Maximalgrenze liefern können. Die in dieser Arbeit verwendeten Laserdioden sind der LDM-445-6000 (LaserTack, Deutschland), der bei 445 nm emittiert, der LDM-465-3500 (LaserTack, Deutschland), der bei 465 nm emittiert, und der HL63283HG (Ushio, Japan), der bei 638 nm emittiert nm und der K808D02FN (BWT, China), die bei 808 nm emittieren und jeweils als Laser 1, Laser 2, Laser 3 und Laser 4 bezeichnet werden. Jede Laserdiode ist in einer Multimode-Faser fokussiert. Um jede Laserdiode in einem manuellen X-Y-Tisch (CXY1, Thorlabs, USA) zu positionieren, wird eine Kollimationslinse (C340TMD, Thorlabs, USA) davor auf einem manuellen Z-Tisch (SM1Z, Thorlabs, USA) platziert ), gefolgt von einer Fokussierlinse (C560TME, Thorlabs, USA), die stabil gehalten wird, und der Faser auf einem Ax-Y-Tisch (CXY1, Thorlabs, USA). Die Faser mit einem Kerndurchmesser von 200 µm und 0,22 NA war einer der vier Eingänge des 4x4-Faser-Leistungskombinierers. Die vier Ausgänge des Faserkombinierers (MPC-4-M21-M41-P23, Lasfiberio, China) enthalten ~25 % der Eingangsleistung jeder Eingangsfaser und sind ebenfalls Multimode-Fasern mit einem 200-µm-Faserkern und 0,22 NA. Einer der Ausgänge ist mit einem speziell angefertigten 95-5 %-Splitter (LTL 500-93310-95-1, LaserComponents Germany GmbH, Deutschland) verbunden und die 5 %-Faser wurde mit der Fotodiode verbunden. Die drei Ausgänge des Leistungskombinierers und die 95 %-Faser des Splitters wurden mit 1,25-mm-Ferrulen (SFLC230, Thorlabs, USA) abgeschlossen und zum Scankopf geleitet.

Der Scankopf (Abb. 5c) besteht aus dem x-y-Tisch (U-723 XY, Physik Instrumente, Deutschland), dem 3D-gedruckten Halter und dem Ultraschallwandler (UST, HFM23, Sonaxis, Frankreich) mit einer Zentralfrequenz von 50 MHz und 112 % relative Bandbreite, 3 mm Brennweite und 0,5 NA, und die vier Ausgangsfasern sind in einem kreisförmigen Muster um den UST angeordnet. Der Ausgang der vier Fasern ist darauf ausgelegt, sich im Brennpunkt des UST zu kreuzen, um eine maximale Energiedichte auf der Probe zu erreichen.

Das Scannen und Aufzeichnen erfolgt in einer schwungvollen Bewegung, wobei der Bühnentreiber als Master im System fungiert. Der x-Tisch bewegt sich geradlinig mit konstanter Geschwindigkeit. Wenn der X-Tisch eine bestimmte Distanz zurückgelegt hat, die der Schrittgröße entspricht, sendet der Treiber des Tisches ein Signal an die AWGs, um die Laserdioden auszulösen. Jede Laserdiode wird mithilfe einer Impulsfolge mit der Wiederholungsrate frep,1–frep,4 für jede Laserdiode und der Anzahl der Impulse Np1–Np4 an jedem Punkt (A-Bild) im B-Bild ausgelöst. Nachdem die Bühne die gewünschte Distanz zurückgelegt hat, ist der B-Scan abgeschlossen und die Bühnen stoppen, sich zu bewegen. Der Y-Tisch wird zur nächsten Y-Position bewegt und der X-Tisch kann nun den nächsten B-Scan in die entgegengesetzte Richtung durchführen. Für die FWMOT-Anregung verwendeten wir frep,1 = 200.000 Hz, frep,2 = 200.125 Hz, frep,3 = 200.250 Hz und frep,4 = 200.375 Hz und Np1 = 100 und Np2 = Np3 = Np4 = 101 Pulse für Laser 1, 2, 3 und 4. Eine detaillierte Ableitung dieser Werte finden Sie in der Ergänzenden Anmerkung 2.

Wir haben die Emissionsspektren der 4 in der multispektralen Laserdiode RSOM verwendeten Laserdioden mit einem Spektrometer (USB4000, OceanOptics, UK) aufgezeichnet und die Spitzenemissionswellenlängen betrugen 444,3, 460,1, 636,8, 804,9 nm mit einer Varianz von 1,6, 1,7, 1,9 , 2,2 nm und ein R2-Konfidenzniveau von mehr als 0,96 für alle Fälle.

Zusätzlich wurde die Energie pro Puls an Proben mit einem stabilisierten Wärmeleistungsmesser (PM160T, Thorlabs, USA) gemessen und für die Laser 1, 2, 3, 4 zu 189, 137, 142, 153 nJ pro Puls berechnet. Die Pulsbreite wurde für jeden Laser auf 6,7, 6,7, 10,2 und 10,2 ns Vollbreite bei halbem Maximum (FWHM) geschätzt. Mit einer USB-CCD-Kamera (daA1920-30 µm; Basler AG, Deutschland) wurde gemessen, dass der Beleuchtungsfleck auf der Oberfläche der Probe ein Kreis mit einem Durchmesser von ~1 mm war. Tabelle 1 enthält eine Zusammenfassung der LD-Puls- und Emissionseigenschaften für den FWMOT-Betrieb, wie oben dargestellt.

Um die FD OA mit der FWMOT-Anregung zu vergleichen, verwendeten wir eine fasergekoppelte 450-nm-Laserdiode (FBLD-450-0,8W-FC105-BTF; Frankfurt Laser Company, Deutschland), verbunden mit einem analogen Lasertreiber (BFS-VRM 03 HP; Picolas, Deutschland). Die Ausgangsfaser des Lasers wurde in eine der Eingangsfasern des 4 × 4-Faserkombinierers gepumpt, sodass die Beleuchtung der Probe für die FD-Anregung und das FWMOT-Anregungssystem identisch ist.

Zur Berechnung des Signal-Rausch-Verhältnisses (SNR) haben wir die folgende Formel verwendet: 10 * log10(S / N), wobei S die Signalintensität und N die Standardabweichung des Grundrauschens ist.

Die Bildaufnahme erfolgt in einem großen Sichtfeld (10 × 10 mm2) und mit einer Scanschrittweite von 10 µm, was deutlich unter der lateralen Auflösung des Systems liegt. Zeitaufgelöste Signale, die an jeder Scanposition erfasst werden, entsprechen der Integration akustischer Kugelwellen, die von den beleuchteten optischen Absorbern innerhalb des Erfassungswinkels des Wandlers ausgehen. Daher sind unverarbeitete Bilder, die direkt vom System erhalten werden, stark unscharf und erfordern eine weitere Verarbeitung, um kontrastreiche und hochauflösende Bilder zu erhalten. Zu diesem Zweck wird ein Rückprojektionsalgorithmus im Fourier-Bereich30,31 implementiert, um ein (akustisch) beugungsbegrenztes Bild wiederherzustellen. Das resultierende Bild wird dann durch die Systemimpulsantwort32 korrigiert und zu Anzeigezwecken mit einem Gefäßfilter weiterverarbeitet33. Die Rohdaten eines einzelnen B-Scans erlauben keine 3D-Bildrekonstruktion. Daher wurde eine vereinfachte Version des Rückprojektionsalgorithmus entwickelt, die in zwei Dimensionen arbeitet und das Empfindlichkeitsfeld des Wandlers nur als Kegelschnitt entlang der B-Scan-Richtung annähert.

Um die räumliche Auflösung des Systems zu berechnen, haben wir ein Auflösungsziel (einen Siemens-Stern) mit allen vier Wellenlängen abgebildet. Die Ergebnisse sind in der ergänzenden Abbildung 3 dargestellt, die die rekonstruierten OA-Bilder des Auflösungsziels bei allen vier Wellenlängen sowie das zusammengesetzte Bild in Polarkoordinaten zeigt. Die räumliche Auflösung ergibt sich aus dem kleinsten Radius, bei dem alle Linien gut aufgelöst werden können (Ergänzende Abbildung 3h), der für alle Wellenlängen 38 µm beträgt.

Hämoglobin hat ein breites Absorptionsspektrum im sichtbaren und nahen Infrarotbereich mit einer höheren Absorption bei den niedrigeren Wellenlängen des Spektrums. Die Absorption von sauerstofffreiem Hämoglobin ist bei 444 nm höher als die Absorption von sauerstoffhaltigem Hämoglobin. Die Absorption von sauerstoffhaltigem Hämoglobin ist bei 460 nm höher als die Absorption von sauerstofffreiem Hämoglobin. Die Gesamtabsorption von Hämoglobin bei den Wellenlängen 1 und 2 ist viel höher als bei den Wellenlängen 3 und 4. Aufgrund der geringen Energieabgabe der Laserdioden reicht dies für die Annahme aus, dass wir OA-Signale von Hämoglobin nur bei den Wellenlängen 1 und 2 erkannt haben Dies wurde durch In-vivo-Mausohrexperimente bestätigt. Darüber hinaus können wir die relativen Änderungen der Sauerstoffsättigung34 abschätzen, indem wir das Verhältnis der Signalintensität von Wellenlänge 2 zu der von Wellenlänge 1, S2/S1, berechnen, wobei ein höheres Verhältnis eine höhere Sauerstoffsättigung anzeigt.

Um den Kontrast zu induzieren und das SNR bei den Wellenlängen 3 und 4 zu erhöhen, verwendeten wir zwei Farbstoffe, Evans Blue (Sigma-Aldrich, Deutschland) und ICG (VERDYE, Deutschland). Evans Blue hat einen Absorptionsmaximum bei 640 nm und ein Minimum bei 740 nm35 und ist daher der geeignete Farbstoff zur Verbesserung des Kontrasts für Wellenlänge 3, da dies die einzige Wellenlänge ist, bei der wir OA-Signale erkennen können. ICG im Blutplasma hat eine Spitzenabsorption bei etwa 810 nm und eine geringe Absorption bei 637 nm36, was es angemessen macht, einen OA-Kontrast bei Wellenlänge 4 mit minimalem Kontrast bei Wellenlänge 3 und keinem Kontrast bei den anderen Wellenlängen zu induzieren, was durch Mausohrexperimente bestätigt wurde .

Mit den oben genannten Werten (Tabelle 1) für jede Laserdiode und einer Scangeschwindigkeit von 10 mm/s bei einer Scanschrittweite von 10 μm können wir die Probenbelichtung berechnen. Die Gesamtbelichtung der Probe bei gleichzeitiger Beleuchtung mit allen vier Wellenlängen wird mit 19,8 µJ/cm2 pro Impuls und einer mittleren Belichtung von 3,96 W/cm2 berechnet und liegt damit deutlich unter den MPE-Grenzwerten von 20 mJ/cm2 und 18 W/cm2, die von der Norm vorgegeben werden American National Standards Institute37. Es wurde gezeigt, dass nichtlineare Effekte bei OA bei hohen Energiedichten über ~7 mJ/cm2 vorhanden sind 38. Die gesamte Probenexposition betrug hier weniger als 20 µJ/cm2, selbst bei gleichzeitiger Beleuchtung mit allen Wellenlängen. Daher lag die deponierte Energie in dieser Studie deutlich unter dem Schwellenwert für nichtlineare Effekte.

Für unsere Experimente verwendeten wir zwei 5 bis 6 Wochen alte weibliche Athymic-Nacktmäuse vom Typ Foxn1nu (Envigo, Deutschland). Während aller Messungen wurden die Mäuse mit 1,6 % Isofluran (cp-Pharma, Deutschland) mit einem Trägergasfluss von 0,8 l/min anästhesiert und die Körpertemperatur wurde mit einer Infrarot-Wärmelampe und einer Heizplatte aufrechterhalten.

Die erste Maus wurde für die in Abb. 3 dargestellten Experimente verwendet. Die lymphatischen Ohrgefäße wurden durch intradermale Verabreichung von 5 µl ICG (5 mg/ml) und 5 µl Evans Blau (1 %) in die Ohrspitze der Maus hervorgehoben. ICG wurde etwa 30 Minuten und Evans Blau etwa 10 Minuten vor Beginn der Bildgebung verabreicht, um die Lymphdrainage der Farbstoffe sicherzustellen.

Für die in Abb. 4 gezeigten Experimente wurde eine zweite Maus verwendet. Für das Sauerstoffstressexperiment haben wir über eine Nasenmaske verschiedene Isofluran-Trägergaskombinationen oder Atembedingungen zugeführt. Die Maus atmete abwechselnd 0,8 l/min 100 % Sauerstoff (O2) und eine Kombination aus 0,6 l/min medizinischer Luft (20 % Sauerstoff) plus 0,2 l/min Kohlendioxid CO2 (Luft). Für das Farbstoffdiffusionsexperiment erfassten wir zunächst die Hintergrunddaten und injizierten nach 3 Minuten intravenös 100 µl 1 % Evans Blue-Lösung und nach weiteren 3 Minuten 100 µl der 5 mg/ml ICG-Lösung. Beide Mäuse wurden unmittelbar nach der Bildgebung durch Genickbruch getötet.

Alle Mausversuche wurden gemäß der Kommission für Tiergesundheit und Tierpflege Oberbayern (Az. ROB-55.2-2532.Vet_02-14-88 und Az. ROB-55.2-2532.Vet_02-18-120) durchgeführt. Die Mäuse wurden in einem individuellen belüfteten Käfigsystem (Tecniplast, Deutschland) bei 22 °C Umgebungstemperatur, ~50 % relativer Luftfeuchtigkeit und mit einem regelmäßigen 12-Stunden-Tag/Nacht-Zyklus in unserer Einrichtung für spezifisch pathogenfreie (SPF) Mäuse gehalten das Zentrum für Translationale Krebsforschung der Technischen Universität München (TranslaTUM).

Einer der Autoren meldete sich freiwillig für diese Studie, um seine Hand abbilden zu lassen. Nach Rücksprache mit der Ethikkommission der TUM war keine formelle Ethikgenehmigung erforderlich. Die Einverständniserklärung des Teilnehmers wurde eingeholt und archiviert. Der Teilnehmer ist ein 30-jähriger weißer Mann. Die Bildaufnahme erfolgte in einem Sichtfeld von 5 × 5 mm2 und mit einer Scanschrittweite von 10 µm. Die rekonstruierten OA-Bilder sind in der ergänzenden Abbildung 2 dargestellt.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Research Reporting Summary.

Die rohen optoakustischen Signaldaten zur Validierung des Frequenz-Wellenlängen-Multiplex-optoakustischen Tomographie-Algorithmus, die rohen Bilddaten von Mäusen und Menschen, die rohen B-Scan-Daten des Sauerstoff-Stresstests und ICG- und Evans-Blue-Injektionsexperimente, die in dieser Studie generiert wurden hinterlegt in der Zenodo-Datenbank unter dem Zugangscode: https://doi.org/10.5281/zenodo.6770729.

Die Autoren erklären, dass für die Datenerfassung die kommerziell erhältliche Software von GaGe (Compuscope Driver Version 5.04.34, Dynamic Signals LLC, USA) und Matlab 2016b (Matlab, Mathworks, USA) verwendet wurde. Die Datenanalyse wurde in Matlab mithilfe der integrierten Funktionen durchgeführt. Der Frequenz-Wellenlängen-Multiplex-Algorithmus für die optoakustische Tomographie wurde patentiert und ist nach Ermessen des jeweiligen Autors erhältlich.

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Die Forschung, die zu diesen Ergebnissen führte, wurde vom Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF), Bonn, Deutschland (Projekt Sense4Life, 13N13855) (VN), vom Europäischen Forschungsrat (ERC) im Rahmen des Forschungs- und Innovationsprogramms Horizont 2020 der Europäischen Union gefördert Programm im Rahmen der Finanzhilfevereinbarung Nr. 694968 (PREMSOT) (VN) und aus dem Forschungs- und Innovationsprogramm Horizon 2020 der Europäischen Union im Rahmen der Finanzhilfevereinbarung Nr. 732720 (ESOTRAC) (VN) und Nr. 862811 (RSENSE) (VN). Wir möchten Dr. Sergey Sulima und Dr. Robert Wilson für ihre Hilfe beim Verfassen des Manuskripts danken.

Open-Access-Förderung ermöglicht und organisiert durch Projekt DEAL.

Lehrstuhl für Biologische Bildgebung am Zentralinstitut für Translationale Krebsforschung (TranslaTUM), Fakultät für Medizin, Technische Universität München, München, Deutschland

Antonios Stylogiannis, Ludwig Prade, Sarah Glasl, Qutaiba Mustafa, Christian Zakian & Vasilis Ntziachristos

Institut für Biologische und Medizinische Bildgebung, Helmholtz Zentrum München, Neuherberg, Deutschland

Antonios Stylogiannis, Ludwig Prade, Sarah Glasl, Qutaiba Mustafa, Christian Zakian & Vasilis Ntziachristos

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AS und LP haben das RSOM-System mit mehreren Wellenlängen entwickelt. LP hat die Frequenz-Wellenlängen-Multiplex-Signalverarbeitungstechnik entwickelt. AS arbeitete weiter am Frequency Wavelength Multiplexed-Algorithmus, entwickelte die übersteuerte CW-LD-Anregungsquelle, führte die Bildgebungsexperimente durch und verarbeitete die Daten. SG unterstützte AS bei der Durchführung der Mäuseexperimente. QM rekonstruierte die optoakustischen Bilder. CZ und VN halfen mit ausführlichen Diskussionen und Anleitung bei der Durchführung dieser Forschung.

Korrespondenz mit Vasilis Ntziachristos.

VN ist Gründer und Anteilseigner von sThesis GmbH, iThera Medical GmbH, Spear UG und i3 Inc. Die übrigen Autoren haben keine konkurrierenden Interessen.

Nature Communications dankt Frans Harren und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Stylogiannis, A., Prade, L., Glasl, S. et al. Frequenz-Wellenlängen-Multiplex-Optoakustische Tomographie. Nat Commun 13, 4448 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-32175-6

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Eingegangen: 06. Juli 2021

Angenommen: 20. Juli 2022

Veröffentlicht: 01. August 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-32175-6

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