Auf dem Weg zum tragbaren Regenbogen-Zytophon mit Laserdioden für die globale Krankheitsdiagnostik

Wissenschaftliche Berichte Band 12, Artikelnummer: 8671 (2022) Diesen Artikel zitieren

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In vivo hat Cytophone seine Fähigkeit zur Frühdiagnose von Krebs, Infektionen und Herz-Kreislauf-Erkrankungen durch photoakustische Erkennung zirkulierender Krankheitsmarker direkt im Blutkreislauf mit einer beispiellosen 1.000-fachen Verbesserung der Empfindlichkeit unter Beweis gestellt. Dennoch wird dringend ein Zytophon mit höherer Spezifität und Portabilität benötigt. Hier stellen wir eine neuartige Cytophone-Plattform vor, die ein multispektrales Miniatur-Laserdiodenarray, Zeit-Farbkodierung und zeitaufgelöste Hochgeschwindigkeitssignalverarbeitung integriert. Mit zweifarbigen (808 nm/915 nm) Laserdioden demonstrierten wir die spektrale Identifizierung von weißen und roten Blutgerinnseln, Melanomzellen und Hämozoin in Malaria-infizierten Erythrozyten vor einem Bluthintergrund und Artefakten. Daten aus einem Plasmodium yoelii-Mausmodell und kultiviertem menschlichen P. falciparum wurden in vitro mit konfokaler Photothermie- und Fluoreszenzmikroskopie verifiziert. Mit diesen Techniken konnten wir infizierte Zellen innerhalb von 4 Stunden nach der Invasion nachweisen, was Hämozoin als vielversprechenden spektralselektiven Marker in den frühesten Stadien des Fortschreitens der Malaria erscheinen lässt. Zusammen mit den Erkenntnissen aus unserer früheren Anwendung von Cytophone mit herkömmlichen Lasern zur Diagnose von Melanomen, Bakteriämie, Sichelanämie, Thrombose, Schlaganfall und abnormalen Hämoglobinformen deutet dieses aktuelle Ergebnis auf das Potenzial für die Entwicklung eines tragbaren Regenbogen-Cytophones mit multispektralem Laser hin Dioden zur Identifizierung dieser und anderer Krankheiten.

Bei der Krankheitsdiagnose wurden mit fortschrittlichen Lasern erhebliche Fortschritte erzielt1. Unter den verschiedenen Lasermethoden haben photoakustische (PA) Techniken Vorteile in Bezug auf Empfindlichkeit, Nichtinvasivität und Eindringtiefe in Biogewebe von bis zu 3 bis 5 cm2,3,4 gezeigt. Mehrere PA-Bildgebungsgeräte haben in vivo beim Menschen vielversprechende klinische Ergebnisse gezeigt, unter anderem bei der Beurteilung des Morbus Crohn-Status5, der Diagnose von Brustkrebs6,7 und der Überwachung der Blutsauerstoffversorgung in Halsvenen8. Die Diagnose dieser und vieler anderer Erkrankungen beginnt oft mit der Untersuchung des Blutes eines Patienten; Allerdings sind bestehende Bluttests nicht in der Lage, eine frühe Diagnose zu stellen, da ihre Empfindlichkeit durch das geringe entnommene Blutvolumen (typischerweise 5–10 ml bei venösen und einige μL bei kapillaren Proben) begrenzt ist, bei dem bis zu 103 bis 104 der abnormalen Zellen übersehen werden oder Biomarker im gesamten Blutvolumen (~ 5 l bei Erwachsenen)9. Dieser große Anteil fehlender Zellen kann zu einem Fortschreiten der Krankheit führen, das zu schwer zu behandeln ist, wie z. B. Metastasen, Sepsis oder Schlaganfälle, die durch zirkulierende Tumorzellen (CTCs), Bakterien bzw. Blutgerinnsel entstehen9,10. Insbesondere werden sie trotz enormer Anstrengungen bei der Entwicklung verschiedener CTC-Tests aufgrund ihrer geringen Sensitivität und inkonsistenten Daten noch nicht für den klinischen Einsatz empfohlen und haben daher einen unklaren diagnostischen Wert, insbesondere für die frühe Krankheitsdiagnose10,11. Darüber hinaus sind die meisten vorhandenen PA-Techniken, insbesondere die PA-Bildgebung, nicht in der Lage, sich schnell bewegende, zirkulierende Krankheitsbiomarker mit typischen Geschwindigkeiten von 5 bis 10 cm/s zu erkennen, selbst wenn sie in subkutanen Gefäßen vorhanden sind, was ihren Nutzen weiter einschränkt10.

Diese Einschränkungen können durch die Beurteilung größerer Blutvolumina in vivo mithilfe des Prinzips der In-vivo-Durchflusszytometrie mit fluoreszierenden, photothermischen (PT), Raman- und insbesondere PA-Nachweismethoden und deren Kombinationen gelöst werden11,12,13. Unter diesen Methoden hat die In-vivo-PA-Durchflusszytometrie (PAFC) klinische Relevanz für den direkten Nachweis von Bakterien (z. B. S. aureus und E. coli), Blutgerinnseln, Sichelzellen, Exosomen und verschiedenen Formen von Hämoglobin (Hb) im Blutkreislauf gezeigt ) (z. B. Oxy-, Desoxy- und Metha-Hb), Nanopartikel (NPs) und CTCs unter Verwendung von intrinsischem (z. B. Melanin, Hb, Hz [Hämozoin], Cytochromen, Carotinoiden) oder künstlichem (z. B. Gold-NPs) PA Kontrastmittel9,12,14,15,16,17,18,19,20. In einer klinischen Studie bot PAFC eine beispiellose Empfindlichkeitsverbesserung um das ~ 1000-fache im Vergleich zu bestehenden Diagnosemethoden zum Nachweis von CTCs, Blutgerinnseln und CTC-Gerinnselembolien bei Melanompatienten in vivo21. Wir haben auch gezeigt, dass In-vivo-PAFC das Potenzial hat, zirkulierende, mit Malaria infizierte Zellen der Maus in einem Tiermodell bei einem Parasitämie-Wert von 0,0000001 % nachzuweisen14,15.

Dennoch ist der Einsatz von PAFC in Ländern mit begrenzten Ressourcen durch die technische Komplexität, Größe und hohen Kosten häufig verwendeter Festkörper-Pulslaser (z. B. Blitzlampen-, diodengepumpte, gütegeschaltete und faseroptische Laser) begrenzt. basierend)1,12. Diese Einschränkungen machen es auch äußerst schwierig, eine Reihe von Lasern mit unterschiedlichen Wellenlängen zu verwenden, was bei der spektralen Identifizierung von Biomarkern mit unterschiedlichen Absorptionsspektren, auch Spektralfingerabdrücke genannt, insbesondere für NPs, Hb und Hz, hilfreich wäre22,23,24 ,25,26,27,28,29,30,31,32,33. Insbesondere nach unserer bahnbrechenden ersten Anwendung spektral abstimmbarer Laserdioden in der PA-Spektroskopie34 wurden einige Versuche unternommen, Laserdioden für die PA-Bildgebung zu verwenden35,36; Allerdings war die Pulsenergie von Laserdioden zu niedrig (im Bereich von einigen Mikrojoule [µJ]), um eine ausreichende Empfindlichkeit zu gewährleisten. Auch die Impulsdauer war im Vergleich zur akustischen Laufzeit über das kleine Ziel relativ lang (90–120 ns), um dem akustischen Einschluss für eine hocheffiziente Erzeugung von PA-Signalen zu entsprechen14,15. In jüngster Zeit wurden erhebliche Fortschritte bei der Entwicklung leistungsfähigerer Laserdioden mit einer Pulsbreite von 15 bis 30 ns und einer Pulsenergie von 0,1 bis 2 mJ bei Emitter-Array-Größen von 0,1 × 5 mm2 bis 40 × 50 mm37 erzielt. Bei der Verwendung dieser Laser mit PAFC wurden jedoch kaum Fortschritte erzielt. Das Ziel der hier beschriebenen Arbeit besteht darin, die Lücke in diesem Forschungsbereich zu schließen, indem eine innovative PAFC-basierte Regenbogen- (d. h. mehrfarbige) Cytophone-Plattform verwendet wird, die ein Miniatur-Laserdiodenarray mit zeitspektraler Lichtmodulation und zeitaufgelöster Zeitauflösung integriert Erkennung zeitlich farbcodierter PA-Signale von jeder sich schnell bewegenden Zelle(n) oder Biomarker(n) und Hochgeschwindigkeits-Signalverarbeitung. Zu den Vorteilen der neuen Laserdioden im Vergleich zu herkömmlichen Laserquellen gehören die geringe Größe, die Verwendung kompakter Emitter-Arrays mit Mikrooptik, die geringen Kosten, die hohe Wiederholrate, die notwendige Laserenergie und die angemessene Pulsdauer.

Um die einzigartige Leistung unseres Regenbogen-Zytophons mit Laserdioden zu veranschaulichen, zeigen wir, dass unsere neuartige Plattform in der Lage ist, die einzigartigen Spektren mehrerer zirkulierender Objekte, einschließlich weißer und roter Blutgerinnsel, mimischer Melanomzellen und Hz, allein und bei Malaria-Infizierten zu identifizieren rote Blutkörperchen (RBCs) im Bluthintergrund und andere Artefakte. Aufbauend auf unseren früheren malariabezogenen Studien mit Festkörperlasern14,15 untersuchen wir nun das Potenzial von Laserdioden als neue vielversprechende optische Quellen, um eine erhöhte PAFC-Spezifität zu ermöglichen. Diese Arbeit erforderte die Bewältigung von Herausforderungen wie geringer Pulsenergie, hoher Strahlungsdivergenz (insbesondere bei Laserdiodenarrays) und der Hochgeschwindigkeitserkennung und -filtration von mehrfarbigen PA-Signalen, die in sich schnell bewegenden infizierten Einzelzellen durch Laserdiodenpulse mit unterschiedlichen Wellenlängen erzeugt werden . Wir haben uns bei unserer neuartigen Plattform besonders auf Malaria konzentriert, die nach wie vor zu den bedeutendsten Infektionskrankheiten gehört und fast die Hälfte der Weltbevölkerung gefährdet, was allein im Jahr 2020 zu 241 Millionen klinischen Fällen und 627.000 Todesfällen führte22. Über 96 % der Todesfälle ereignen sich in Afrika, fast alle aufgrund der Plasmodium falciparum-Art, obwohl mindestens vier weitere Arten weltweit für Infektionen beim Menschen verantwortlich sind. Malaria stellt einen potenziell idealen Anwendungsfall für PAFC dar, da auf die Invasion und das Wachstum des Parasiten in Erythrozyten die Erzeugung eisenreicher Hz folgt, die aufgrund der Ähnlichkeiten in PA-Kontrasten analog zu dem, was in Melanom-CTCs nachgewiesen wird, nachgewiesen werden können21 optische und geometrische Eigenschaften zwischen Melanin und Hz14. Der Goldstandard für die Malariadiagnose war die Lichtmikroskopie von Blutproben, die die Speziation und Parasitenquantifizierung ermöglicht, obwohl neuere qualitative Schnelldiagnosetests (RDTs) die Mikroskopie in endemischen Gebieten schnell überholt haben23,24,25,26,27,28,29 ,30,31,32,33. Leider weisen beide Point-of-Care-Diagnostika eine begrenzte Empfindlichkeit auf, mit Nachweisgrenzen von 50 bis 200 Malaria-infizierten Erythrozyten (iRBCs)/µL, die Durchführung dauert mindestens 20 bis 30 Minuten und RDTs werden zunehmend durch Zielantigen-Deletionen behindert. Während die herkömmliche Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und insbesondere RNA-basierte Methoden eine verbesserte Empfindlichkeit auf bis zu 1 Parasit/µL oder mehr aufweisen, ist ihr Nutzen in Point-of-Care-Umgebungen aufgrund des Zeit-, Maschinen- und Verbrauchsmaterialbedarfs begrenzt Fehleranfällig, da Spuren von Schadstoffen zu einer Fehldiagnose führen können23.

Die Weltgesundheitsorganisation (WHO) strebt an, bis zum Jahr 2030 weltweit die Zahl der Malaria-bedingten Todesfälle um mindestens 90 % zu senken22. Allerdings sind derzeit keine Malariatests auf dem Markt zu angemessenen Kosten erhältlich oder ausreichend empfindlich, um asymptomatische Personen zu identifizieren stellt ein entscheidendes Hindernis bei der Ausrottung der Malaria dar. Unsere Arbeit kann der Forderung der WHO gerecht werden, indem wir das erforderliche tragbare, nichtinvasive (nadellose), kennzeichnungsfreie (keine Kontrastmittel) und sichere (keine Hautschäden, Schmerzen oder Blutkontaminationsprobleme) Gerät entwickeln. Hier berichten wir über die Verwendung einer neuartigen Regenbogen-(Mehrfarben-)Cytophone-Plattform mit kleinen, kostengünstigen Laserdioden für die schnelle (in Sekunden) Erkennung und Echtzeit-Identifizierung von Plasmodium-infizierten Erythrozyten in vitro und in einem Mausmodell in vivo mit a hohes Potenzial für die Übertragung auf den Menschen.

Das besondere Merkmal der neuartigen Rainbow-Cytophone-Plattform (Abb. 1a) ist die Verwendung eines multispektralen Laserdiodenarrays, das Laserimpulse mit unterschiedlichen Wellenlängen und der Zeitverzögerung für die Zeit-Farbkodierung erzeugt (Abb. 1b). Um diese Plattform zu validieren, haben wir Laserdiodenimpulse im Nanosekundenbereich (15–25 ns) mit hoher Pulswiederholungsrate (1–3 kHz) bei zwei Wellenlängen, 808 nm und 915 nm, angewendet. Die transkutane Laserbestrahlung der Gefäße durch intakte Haut führt zu einem Temperaturanstieg der lichtabsorbierenden PA-Kontrastmittel, wie Hb in normalen Erythrozyten (nRBCs) und Hz mit höherer lokaler Absorption in iRBCs als Hb in nRBCs im nahen Infrarot (NIR)-Region (Abb. 1c). Die schnelle thermische Ausdehnung erhitzter Zonen führt zur thermoakustischen Erzeugung akustischer Wellen, die als PA-Signale bezeichnet werden und mit einem kleinen Ultraschallwandler (US) (einige mm Durchmesser) erfasst werden (Abb. 1a).

In-vivo-Regenbogen-Cytophone-Diagnoseplattform. (a) Das Prinzip des zweifarbigen Zytophons; Einschübe zeigen eine schematische Darstellung der iRBC-Struktur (oben links) und ein photothermisches (PT) Bild eines tatsächlichen iRBC (unten rechts) mit Hz-Peaks. (Adobe Fireworks CS5, www.adobe.com) (b). Zeitliche Farbkodierung zweier hochwiederholfrequenter Laserpulse mit unterschiedlichen Wellenlängen von λ1 und λ2 – (oben) – zur spektralen Identifizierung von iRBCs (Mitte) im Hintergrund synchronisierter (z. B. von pigmentierter Haut) und unsynchronisierter Fehlsignale ( unten). (c) Absorptionsspektren von Melanin, nRBCs, Hz, Indocyaningrün (ICG) und magnetischen Perlen14,15,16,17,18,19,20,21. (d) PA-Spuren mit positivem und negativem PA-Kontrast vor einem Bluthintergrund, der durch viele nRBCs und zirkulierende Blutgerinnsel (CBCs) erzeugt wird.

PA-Signale von Hb in nRBCs im Nachweisvolumen erzeugen eine Spurenbasislinie (Abb. 1d). Wenn iRBCs mit einer höheren Hz-bedingten lokalen optischen Absorption über dem Hb-Hintergrund von nRBCs das Detektionsvolumen (d. h. das bestrahlte Volumen) passieren, nimmt die entsprechende Absorption zu und erzeugt scharfe positive vorübergehende PA-Peaks über dem Bluthintergrund. Zum Vergleich erzeugen weiße und rote zirkulierende Blutgerinnsel (CBCs) negative und positive PA-Peaks (Abb. 1d).

Basierend auf den besonderen Merkmalen der Absorptionsspektren von Hz in iRBCs und Hb in nRBCs, insbesondere ihrer unterschiedlichen Absorption im Spektralfenster von 770 bis 930 nm, haben wir den Zweifarbenmodus ausgewählt, um die Fähigkeit von Cytophone zu demonstrieren, iRBCs spektral mit zwei Lasern zu identifizieren Impulse bei 808 und 915 nm und eine kurze elektronische Zeitverzögerung τE (10 μs) für die Zeit-Farbkodierung (Abb. 1b, oben). Diese Impulse mit einer Wiederholungsrate von 3 kHz interagieren mit denselben sich schnell bewegenden Einzelzellen, wodurch von denselben Zellen zeitlich farbcodierte PA-Signale erzeugt werden, wenn sie das Detektionsvolumen passieren (Abb. 1a). Insbesondere erzeugen iRBCs PA-Signale mit höheren Amplituden bei 808 nm als bei 915 nm (Abb. 1b, Mitte), während nRBCs PA-Signale mit höheren Amplituden bei 915 nm als bei 808 nm erzeugen, wie bei roten CBCs (Abb. 1b, unten, Rechts). Die Kombination der zeitlichen Farblaserimpulskodierung mit der zeitaufgelösten PA-Signalerkennung ermöglicht auch die Identifizierung eines Paares synchronisierter echter PA-Signale von iRBC im Gefäß, die mit einer gut aufgelösten akustischen Zeit zum Wandler gelangen (Abb. 1a). Verzögerung τA (≥ 0,2 µs) im Vergleich zu paarweise synchronisierten Hintergrundsignalen aus der pigmentierten Hautschicht (Abb. 1b, unten, links) sowie den nicht mit Laserpulsen synchronisierten falschen Signalen (Abb. 1b, unten, Mitte) unterschiedlicher Ursachen (z. B. durch Vibration, Umgebungsakustik und elektromagnetische Interferenzen).

Im Zytophon werden nach einem sogenannten Fast-Axis-Collimation-System (FAC) (Abb. 2a,b) unter Verwendung eines Mikrolinsenarrays die Strahlen zweier Laserdioden in koaxialer Richtung mit einem dichroitischen Spiegel gemischt (Abb. 2a). . Die Fokussieroptik, bestehend aus einer sphärischen und zylindrischen Linse, formt einen linearen Strahl mit einer Breite von ca. 80 µm und einer Länge von 1 mm. Die beiden kompakten Emitter-Arrays (Abb. 2b) liefern zwei Wellenlängenpulse (Abb. 2c) mit einer Energie von 110 bis 130 µJ. Lichtstreuung im Biogewebe führt zu einer Unschärfe des Laserstrahls, die die optische Auflösung deutlich verringert (Abb. 1a). Um eine höhere räumliche Auflösung zu erzielen, haben wir das Cytophone-Schema mit akustischer Auflösung unter Verwendung des fokussierten zylindrischen US-Wandlers mit einer lateralen Auflösung von 65 ± 9 µm angewendet. Die zylindrische Wandlerkonfiguration ermöglicht es uns, das Erkennungsvolumen und damit den Bluthintergrund von nRBCs zu minimieren und so das Signal-Rausch-Verhältnis (SNR) von iRBCs zu maximieren und gleichzeitig alle iRBCs im gesamten Blutgefäßquerschnitt zu bewerten. Um PA-Signale mit den typischen bipolaren Wellenformen (Abb. 1b, Mitte) zu sammeln, wurde die Plattform mit einer Analog-Digital-Wandlerplatine ausgestattet. Die PA-Signalwellenformen wurden 4- bis 16-fach gemittelt, um das SNR zu erhöhen, und dann analog zur herkömmlichen Durchflusszytometrie in Spuren umgewandelt12 (Abb. 1d). Infolgedessen erzeugt Cytophone Spurenpeaks mit positiven und negativen Kontrasten vor einem Bluthintergrund (Abb. 1d). Die Eigenschaften (z. B. Amplitude und Breite) für jeden Peak über dem festgelegten Hintergrundniveau wurden dann mithilfe einer maßgeschneiderten MATLAB-basierten Software analysiert.

In-vivo-Zweifarben-Zytophon-Aufbau mit zwei Laserdioden. (a) Optisches Schema. (Adobe Fireworks CS5, www.adobe.com) (b) Foto von zwei Laserdiodenmodulen mit zwei Wellenlängen. (c) Spektren der Laserdiodenemission mit zentralen Wellenlängen von 808 und 915 nm. (d) PA-Mikroskopbilder des Mausohrfragments bei 532 nm (oben) und 820 nm (unten). FAC = Fast-Axis-Kollimationssystem; ADC = Analog-Digital-Wandler.

Um herauszufinden, ob die Cytophone-Plattform mit akustischer Auflösung und fortschrittlichen Laserdioden sowohl diagnostischen Wert als auch eine hohe spektrale Spezifität bieten kann, verglichen wir ihre Leistung in vivo und in vitro mit der herkömmlichen PAFC, die Feststofflaser bei Wellenlängen von 532, 671, 820 und 1.064 verwendet nm. Zu diesem Zweck verwendeten wir unsere fortschrittlichen Gefäßphantome38,39 und krankheitsbedingte PAFC-Kontrastmittel, einschließlich Magnetkügelchen, die Melanom-CTCs nachahmen38. Die Wirkstoffe wurden intravenös oder peritoneal in den Körper der Maus verabreicht, gefolgt von einem PA-Nachweis in Ohrgefäßen mit einem Durchmesser von 40 bis 60 µm (Abb. 2d). Der PA-Kontrast der Blutgefäße war bei 820 nm geringer als bei 532 nm (~ 20-fach), was mit dem Absorptionsspektrum von Hb korreliert (Abb. 1c). Diese spektrale Signatur erhöht den PA-Kontrast von iRBCs über dem Bluthintergrund, da die Hz-Absorption in iRBCs nur geringfügig abnahm.

Das zweifarbige Zytophon mit Laserdioden mit zwei Wellenlängen wurde zunächst in vitro durch spektrale Identifizierung traditioneller PAFC-Kontrastmittel unter dynamischen Bedingungen validiert, wobei unser dynamisches Blutgefäßphantom mit sich schnell bewegenden Blutzellen, CTCs und Gerinnselphantomen unter gut kontrollierbaren Flussbedingungen verwendet wurde38 ,39. Dieses Phantom bestand aus Polyvinylchlorid-Plastisol mit TiO2-Nanopartikeln, die Biogewebe mit medizinisch geeigneten Streu- und Absorptionseigenschaften modellierten, einer Melanin-Oberflächenschicht, die die pigmentierte Haut nachahmte, Kunststoffröhren mit unterschiedlichen Durchmessern und Tiefen, die Blutgefäße nachahmten, und einer Pumpe, um Zellphantome zu bewegen reale Zellen mit Geschwindigkeiten von 0,5–5 cm/s. Um fließende Zellen und Artefakte nachzuahmen, die falsche Signale erzeugen können, haben wir (1) 8-µm-Magnetkügelchen mit einer Absorption im NIR-Bereich getestet, ähnlich der von Melanomzellen (Abb. 1c); (2) RBC-Aggregate im menschlichen Blut, die rote CBCs imitieren; 3) 100 µm große optisch transparente Silikatkügelchen als weiße CBCs-Phantome; (4) Indocyaningrün (ICG)-Farbstoff, um einen Massenabsorptionshintergrund mit ICG-Aggregaten als rote CBC-Phantome bereitzustellen; und (5) im Handel erhältliches Hz.

In unserer ersten Studie verwendeten wir ICG-Farbstoff mit einem gut charakterisierten Absorptionsspektrum bei einer maximalen Wellenlänge nahe 808 nm (Abb. 1c), um die Leistung von Zweifarben-Zytophonen abzuschätzen. Mithilfe konventioneller Hellfeldmikroskopie konnten wir das Vorhandensein kleiner ICG-Aggregate in einer relativ homogenen Lösung identifizieren (Abb. 3a, rechts). Die höhere lokale Absorption von ICG-Aggregaten über der ICG-Absorptionshintergrundlösung führte zur Erzeugung scharfer positiver PA-Peaks über der Basislinie im Fluss mit einer Geschwindigkeit von 1 cm/s in einem Gefäßphantom mit 1 mm Durchmesser (Abb. 3a, links). . Diese Peaks traten bevorzugt bei 808 nm auf, da die optische Absorption von ICG bei 915 nm (zweite verwendete Farbe) etwa neunmal niedriger ist als bei 808 nm (Abb. 1c).

Validierung der Zweifarben-Zytophonleistung (808 nm/915 nm) durch spektrale Identifizierung herkömmlicher PA-Ziele mit positiven und negativen Kontrasten in vitro unter Verwendung des dynamischen Gefäßphantoms. (a) PA-Spuren mit den positiven Kontrastpeaks seltener Indocyaningrün-Aggregate (ICG) in relativ homogener ICG-Lösung (links) und Hellfeldbild des ICG-Aggregats (rechts). (b) Zweifarbige PA-Spuren von RBC-Aggregaten im Blut mit „einfarbigem“ Artefakt (links) und Hellfeldbild des RBC-Aggregats (rechts). (c) Negativkontrast-PA-Peaks von Silicakügelchen als weiße Phantome von zirkulierenden Blutgerinnseln (CBC) (links) und Hellfeldbild eines einzelnen Kügelchens (rechts). (d) PA-Peaks mit positivem und negativem Kontrast von roten und weißen Blutkörperchen im Blut (links) und Hellfeldbild gemischter rot-weißer Blutkörperchen im Blut (rechts). (e) Zweifarbige PA-Signale mit positivem Kontrast von 23-µm-Magnetkügelchen im Hintergrund vieler 8-µm-Magnetkügelchen. (f) Zweifarbige positive PA-Peaks von synthetischem ~ 200 µm Hz.

Als nächstes erhielten wir zweifarbige PA-Peaks (Abb. 3b, links) aus Erythrozytenaggregaten im Blut (Abb. 3b, rechts). Die PA-Spitzenamplituden bei 808 nm und 915 nm stimmen mit dem RBC-Absorptionsspektrum überein (Abb. 1c). Wir beobachteten auch einen einzelnen Peak bei 808 nm, der mit dem hinzugefügten ICG-Aggregat zusammenhängt. Diese Daten deuten darauf hin, dass ein zweifarbiges Zytophon das Potenzial hat, ein ausgewähltes Ziel (z. B. rote Blutkörperchen) in Gegenwart anderer Artefakte auf der Grundlage spezifischer Fingerabdrücke zu identifizieren.

Um die Leistung des Zweifarben-Zytophons weiter zu bewerten, haben wir seine Fähigkeit geschätzt, weiße CBCs zu identifizieren, die aufgrund einer geringeren Absorption als nRBC-bezogene Hintergründe negative Kontrastspitzen liefern (Abb. 1d). Eine Suspension wurde durch Zugabe von 30 mg Silicakügelchen mit 100 µm Durchmesser (Abb. 3c, rechts) zu 1,5 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) hergestellt und die Suspension alle 15 Minuten geschüttelt, um eine Sedimentation und Aggregation der Mikropartikel zu verhindern. Anschließend haben wir eine ICG-Lösung hinzugefügt, um einen Bluthintergrund zu modellieren. Wir beobachteten zweifarbige (808 nm/915 nm), schmale PA-Peaks mit negativem Kontrast, die mit dem plötzlichen Abfall der Absorption im Detektionsvolumen verbunden waren, als einzelne transparente Siliciumdioxidkügelchen durch den Laserstrahlbereich gingen (Abb. 3c, links). Gemischte rote und weiße CBCs im menschlichen Blut (Abb. 3d, rechts) erzeugten positive und negative Kontrast-PA-Peaks bei 915 nm (Abb. 3d, links). In der Vergangenheit haben wir Nanosekunden-Feststofflaser verwendet, um vergleichbare negative PA-Kontraste16,46 unter Verwendung ähnlicher CBC-Parameter zu erhalten. Die Ähnlichkeit dieser Ergebnisse weist auf die Möglichkeit hin, Festkörperlaser für dieselbe Anwendung durch Laserdioden zu ersetzen.

Als nächstes verwendeten wir relativ seltene 23-µm-Magnetkügelchen im Hintergrund vieler 8-µm-Magnetkügelchen (40 µl 1 %-Kügelchen in 3.960 µl PBS), um als Ersatz für CTC- bzw. nRBC-Phantome38 zu dienen. Wir beobachteten viele zweifarbige (808 nm/915 nm) vorübergehende schmale positive Peaks der einzelnen relativ großen Magnetkügelchen über dem durch kleine Kügelchen modellierten „Bluthintergrund“ (Abb. 3e). Die PA-Peak-Amplituden (rot, 808 nm; blau, 915 nm) stimmen mit dem Absorptionsspektrum der magnetischen Mikropartikel überein (Abb. 1c). Diese Daten sind bei SNRs im Bereich von 5 bis 12, die zuvor mit einem 1.064-nm-Laser unter ähnlichen Bedingungen gemessen wurden, sehr ähnlich38. Auch diese vergleichbare Empfindlichkeit weist auf die Möglichkeit hin, die Laserdioden in einer ähnlichen Anwendung einzusetzen.

Um schließlich das Potenzial von Laserdioden zum Nachweis von Malaria-assoziiertem Hz zu überprüfen, haben wir versucht, im Handel erhältliches Hz in vitro nachzuweisen, dessen optische Absorptionsspektren und Morphologie (Größe und Form) (Abb. S1) dem nativen Hz ähneln30,31, 32,33. Unsere Ergebnisse zeigen, dass Cytophone Hz mit PA-Signalamplituden bei 808 nm besser erkennen kann als bei 915 nm (Abb. 3f), was mit dem Hz-Absorptionsspektrum korreliert (Abb. 1c).

Zusammenfassend zeigen wir anhand von In-vitro-Flussbedingungen, dass die Cytophone-Plattform mit Laserdioden das Potenzial hat, mehrere Ziele zu erkennen und zu identifizieren (z. B. ICG-Aggregate, Magnetkügelchen, weiße und rote CBCs und Hz).

Nach einer umfassenden In-vitro-Verifizierung mit Kontrastmitteln, die für PA-Techniken gut etabliert sind, testeten wir die Zytophonleistung in vivo, indem wir PA-Signale von Ohrmikrogefäßen bei Kontrollmäusen und infizierten Mäusen überwachten (Abb. 2d). Die aus der ersten Kohorte von 5 gesunden Mäusen gesammelten Daten wurden zur weiteren Optimierung der Parameter verwendet. Die PA-Sonde, die aus einer optischen Fokussierungsspitze und einem US-fokussierten Wandler besteht, wurde auf der Ohrhaut über der ausgewählten Vene positioniert und Standard-US-Gel sorgte für eine akustische Kopplung. Die Navigation des Fokusvolumens des Wandlers auf der untersuchten Vene wurde durch optische Bildgebung und Überwachung der PA-Signale genau gesteuert, während die PA-Sonde in verschiedene Richtungen scannte (Abb. S2). Die PA-Signalamplituden der ausgewählten Venen waren 1,65 ± 0,32 (SD)-mal höher als die Hintergrundsignale der Haut. PA-Signale mit typischen Breiten von 0,06–0,1 µs (Abb. 4a) kamen von den Gefäßen mit einer typischen Tiefe von 200 bis 250 µm mit einer gut ausgeprägten akustischen Zeitverzögerung (0,15–0,3 µs) zum Wandler. Dadurch konnten wir den Einfluss von PA-Hintergrundsignalen der Haut auf die Empfindlichkeit des Zytophons durch zeitaufgelöste PA-Erkennung von Signalen nur von zirkulierenden Objekten leicht eliminieren. Infolgedessen wurden bei Kontrollmäusen keine vorübergehenden positiven PA-Signale über dem etablierten Bluthintergrund bei zwei Wellenlängen beobachtet (Abb. 4b). Die geringe Amplitudenschwankung des Bluthintergrunds (Grundlinie), typischerweise 3 % bis 5 %, hängt von der Schwankung der Laserenergie, elektrischem und akustischem Rauschen, Vibration, physiologischer Bewegung und einer leichten Schwankung der Anzahl der nRBCs im Detektionsvolumen ab . Die Anzahl der nRBCs ist in kleinen Gefäßen (10–15 µm) höher.

In-vivo-Überwachung von zweifarbigen (808 nm / 915 nm) PA-Spuren in Kontrollmäusen und mit Malaria infizierten Mäusen mit P. yoelii GFP+-Parasiten. (a) Zeitaufgelöste Erkennung der PA-Signalwellenform bei einer Kontrollmaus aus einem Ohrgefäß im Vergleich zur Haut. (b) In-vivo-PA-Spuren von einer gesunden (Kontroll-)Maus. (c) In-vivo-PA-Spuren einer nicht infizierten Maus mit Erythrozytenaggregaten. In-vivo-PA-Spuren einer infizierten Maus 13 (d), 16 (e) und 21 (f) Tage nach der Infektion. (g) In-vivo-Verifizierung von Zytophondaten auf Laserdiodenbasis durch Testen derselben infizierten Maus mithilfe der PAFFC-Plattform, die PAFC (untere Spur) und das Fluoreszenz-Durchflusszytometriemodul (FFC) (obere Spur) integriert. (h) In-vivo-Abhängigkeit der PA-Raten (Anzahl der PA-Signale pro Minute) von der Zeit nach der Infektion.

Als nächstes testeten wir die Fähigkeit des Zytophons, RBC-Aggregate (dh rote Hb-reiche CBCs) in vivo zu erkennen. Mithilfe bewährter Verfahren12,21,46 und niedriger Temperaturen haben wir Erythrozytenaggregate erzeugt, die mit optischer Hochgeschwindigkeitsbildgebung46 identifiziert wurden. Die Aggregate, die sich durch das Detektionsvolumen (bestrahlt) bewegten, erzeugten gleichzeitig vorübergehende positive PA-Peaks in Zweifarbenkanälen (Abb. 4c). Die Amplituden bei gleicher Laserenergie waren bei 915 nm etwas höher (15–20 %) als bei 808 nm, was mit den Blutabsorptionsspektren übereinstimmt (Abb. 1c).

Als nächstes wurde den Mäusen GFP-exprimierendes P. yoelii intraperitoneal injiziert14. Die Parasitämie wurde durch tägliches Überwachen der PA-Signalamplituden und -Raten (Anzahl der PA-Signale pro Zeiteinheit) über einen Zeitraum von etwa einem Monat bewertet (siehe ausgewählte Beispiele in Abb. 4d – f). Um die mit Laserdioden erhaltenen Daten zu verifizieren, haben wir dieselben Mäuse mit unserem etablierteren integrierten PAFC- und Fluoreszenz-Durchflusszytometrie-System (FFC) (bezeichnet als PAFFC)14 getestet und dabei einen gepulsten Festkörperlaser mit einer Wellenlänge von 671 nm verwendet, um PA-Signale zu erzeugen sowie ein Dauerstrichlaser (CW) bei 488 nm zur Anregung der Emission in GFP-exprimierenden Parasiten. Die multimodale PAFFC-Kapazität ermöglichte es uns, iRBCs durch das zeitliche Zusammentreffen von FL- und PA-Signalen von Parasiten zu identifizieren, die sowohl GFP als auch Hz in iRBCs enthalten (Abb. 4g). Das Vorhandensein nur eines PA-Peaks (d. h. nicht FL-bezogener Peaks) deutete darauf hin, dass die Hz allein im Blutplasma vorkamen oder Hz in Leukozyten (z. B. Neutrophilen) verschlungen waren14,26.

Im Allgemeinen bestätigte PAFFC die Cytophone-Daten, die auf das Vorhandensein von iRBCs in denselben infizierten Mäusen hinweisen. Die Überwachung von PA-Signalen bei infizierten Mäusen über einen Monat hinweg ergab die folgende Tendenz während des Fortschreitens der Malaria: (1) allmählicher Anstieg der Signalrate während der ersten 15 (wir begannen am Tag 13) bis 16 Tage; 2) Erreichen eines Maximums nach 15 bis 17 Tagen; und (3) schließlicher Rückgang bis zum vollständigen Verschwinden nach 28–30 Tagen (Abb. 4h), was mit unserer vorherigen Studie übereinstimmt14,15. Dieses Muster ist gut beschrieben und steht im Zusammenhang mit der immunvermittelten Clearance im Mausmodell14. Die mit Laserdioden erhaltenen Daten stimmen mit den mit Festkörperlasern erhaltenen Daten überein14,18, mit einigen leicht unterschiedlichen Merkmalen je nach Gefäßposition, Flussrate und Immunantwort.

Die In-vivo-PA-Überwachung von künstlichen Hz, magnetischen NPs und B16F10-Melanomzellen, die in eine Schwanzvene injiziert wurden, ergab, dass magnetische NPs und Melanomzellen (Abb. S3) relativ schnell (20 Minuten bis einige Stunden) entfernt wurden, was mit unseren Ergebnissen übereinstimmt vorherige Ergebnisse9,12. Während der PA-Sondenabtastung entlang der Gefäße beobachteten wir stationäre PA-Signale mit einer zufälligen räumlichen Verteilung. Diese Signale hatten eine relativ stabile Amplitude und waren gut von scharfen (dh kurz anhaltenden) vorübergehenden PA-Peaks zu unterscheiden, die von sich schnell bewegenden iRBCs erzeugt wurden. Dieser Befund deutet auf das mögliche Vorhandensein sequestrierter iRBCs (dh an den Gefäßwänden haftend) hin. Bemerkenswert ist, dass die Sequestrierung von iRBCs in Endothelgefäßen und anderen Geweben ein gut beschriebenes Phänomen bei Malaria ist23,25.

Als nächstes analysierten wir Ex-vivo-Proben von Plasmodium-infizierten Mäusen mit denselben Zytophon-/Laserdioden- und PAFFC-/Feststofflaser-Plattformen unter Verwendung unseres dynamischen Blutgefäßphantoms mit fließenden Blutproben38,39. In Blutproben aus den Kontrollblutproben (dh nicht infizierten Mäusen) wurden weder mit dem zweifarbigen Zytophon (Abb. 5a) noch mit dem multimodalen PAFFC (Abb. 5c) Signale über den festgelegten Rauschpegeln beobachtet. Im Gegensatz dazu wurden sowohl Hz-bezogene PA-Signale als auch GFP-assoziierte FL-Signale von iRBCs mit GFP-exprimierendem P. yoelii mit einer ähnlichen Rate im gleichen Infektionsstadium beobachtet wie bei gepaarten In-vivo-Daten. Insbesondere korrelierte das zeitliche Zusammentreffen zweifarbiger PA-Peaks (Abb. 5b) mit den Absorptionsspektren von Hz (Abb. 1c), was deutlich auf den Hz-bezogenen Ursprung der PA-Signale hinweist. Darüber hinaus bestätigt die zeitliche Koinzidenz von PA- und FL-Signalen (Abb. 5d) diese Schlussfolgerung, wenn man bedenkt, dass sich Hz innerhalb von GFP-exprimierenden P. yoelii-iRBCs befinden sollte. Zur Identifizierung ausreichende Hz-assoziierte PA-Signalamplituden wurden durch Laserdioden oberhalb des Hintergrundrauschens induziert (Abb. 5b) und waren mit denen vergleichbar, die durch Festkörperlaser induziert wurden (Abb. 5d). Dies bestätigt die Fähigkeit von Cytophone, Plasmodium-iRBCs zu erkennen. Darüber hinaus war das SNR für PA-Kanäle typischerweise höher als für FL-Kanäle, was auf den Vorteil von Cytophone als Diagnoseplattform im Vergleich zu FFC-Modulen hinweist. Darüber hinaus erfordert FFC die Kennzeichnung von iRBCs in vivo, was nicht einfach ist, und die meisten FL-Kennzeichnungen sind für den Menschen toxisch.

Ex-vivo-Verifizierung von In-vivo-Zytotophondaten mithilfe des Blutgefäßphantoms. Zweifarbige PA-Spur aus (a) Kontrollblut (nicht infizierte Maus) und (b) GFP + P. yoelii-infiziertem Mäuseblut 13 Tage nach der Infektion unter Verwendung von Cytophone mit zwei Laserdioden bei 808 nm und 915 nm. (c) Fluoreszenz- und PA-Spuren aus Kontrollblut unter Verwendung der PAFFC-Plattform (die PAFC- und FFC-Module integriert) mit Pulslasern bei 671 nm und Dauerstrichlasern bei 488 nm zur Erzeugung von PA- und Fluoreszenzsignalen (FL). (d) Ex-vivo-Fluoreszenz- und PA-Spur aus GFP+ P. yoelii-infiziertem Mäuseblut am Tag 13 unter Verwendung der PAFFC-Plattform. Zweifarbige PA-Spuren wurden mit einer zweifarbigen Cytophone-Plattform unter Verwendung von Lasern bei 671 nm und 820 nm aus (e) menschlichem Kontrollblut und (f) P. falciparum-iRBCs aus In-vitro-Kulturen erhalten. (g) Fragment der Spur, das die zeitliche Koinzidenz von PA-Peaks bei verschiedenen Wellenlängen desselben iRBC zeigt.

Um die PA-Daten zu verifizieren, verwendeten wir auch die konfokale photothermische Mikroskopie (PTM)40,41,42,43,44,45, eine von uns entwickelte Technik, die sehr ähnliche physikalische Prinzipien wie PA-Techniken aufweist (d. h. Umwandlung der absorbierten Lichtenergie). in Hitze), jedoch mit verbesserter In-vitro-Bildauflösung40,41,45. Während Cytophone PA-Wellen aufgrund der thermischen Ausdehnung erhitzter Zonen erkennt, werden bei PTM die thermischen Effekte durch Defokussierung des Sondenstrahls aufgrund der Änderungen im temperaturempfindlichen Brechungsindex40,41,42,43,44,45 erkannt. Die Vorteile von PTM in vitro im Vergleich zu anderen optischen Techniken sind seine verbesserte Empfindlichkeit und räumliche Auflösung41, die es uns ermöglichen, die Fähigkeit des Zytophons zu überprüfen, einzelne Hz-Nanokristalle durch ihre PTM-basierte Visualisierung allein oder innerhalb von Zellen zu identifizieren. Wie bereits erwähnt, haben wir kommerziell erhältliches Hz mit ähnlichen Eigenschaften wie natürliches Hz30,31,32,33 verwendet. TEM-, STEM- und EDS-Instrumente (Abb. 6a – c; ergänzende Abb. 1Sa – d) zeigten eine hohe Heterogenität in Hz-Größe und -Form, beginnend während des anfänglichen Keimbildungsprozesses als nicht ideale würfelkugelförmige Nanokristalle mit einer Mindestgröße von 60 bis 80 nm und verwandeln sich in längliche Strukturen mit einem Größenverhältnis (lange zur kurzen Seite) von 2:1, meist 3:1 mit einer maximalen Länge von bis zu 1 mm. Einzelne Nanokristalle können während ihres Wachstums eine Kette einzelner Nanokristalle („linearer Cluster“) bilden. Bei hoher Konzentration wird Hz häufig aggregiert, mit einer durchschnittlichen Hz-Clustergröße zwischen 250 und 500 nm und einem Medianwert von 320 nm. Im Gegensatz zu TEM und STEM erfordert PTM normalerweise keine hochspezifische, zeitaufwändige Vorbereitung (nur wenige Minuten). Mit einer 40-fach-Objektivlinse zeigten PTM-Bilder von Hz ähnliche Ergebnisse, einschließlich einer gewissen Heterogenität (Abb. 6e–g) mit einer recht symmetrischen Größenverteilung um einen Medianwert von 330 nm (Abb. 6i). Nach dem Zerfall von Hz-Clustern durch Ultraschall konnte PTM mit einer 100-fachen Objektivlinse einzelne Hz-Nanokristalle mit beugungsbegrenzter Auflösung auf einem Niveau von 220 nm unterscheiden (Abb. 6f). Diese Nanokristalle lieferten gut nachweisbare PA-Signale (z. B. Abb. 3f und S3a) mit Amplituden, die mit denen von Melanin-Nanopartikeln in Melanomzellen vergleichbar oder höher waren (Abb. S3b, c). Da die Verwendung von PA- und PT-Techniken zur Untersuchung von Melanomen gut etabliert ist21, können diese Techniken problemlos zur Malariaerkennung mit Laserdioden übernommen werden, die herkömmliche Laserquellen ersetzen können.

Charakterisierung von Hämozoin (Hz) allein zur Kalibrierung von Zytophon- und PTM-Systemen. (a) STEM-Bild von Hz-Clustern. TEM-Bilder eines einzelnen (b) und geclusterten (c) Hz. (d) Absorptionsspektrum von synthetischem Hz. Spektrale Absorption von Hz und zum Vergleich magnetische Mikropartikel mit einem Durchmesser von 5,5 µm. Transmissions-/Hellfeldbilder (e) und (g) sowie photothermische Bilder (f) und (h) von kleinen einzelnen Hz bei niedriger Konzertation (5 µg/ml) nach Ultraschallbehandlung (24 kHz, 5 Min.) und geclusterten Hz bei hoher Konzertation (25 µg/ml). (i) Histogramm der Hz-Kristallgrößenverteilung, erhalten mit photothermischer Mikroskopie (PTM); Fehlerbalken stellen die Standardabweichung dar, n = 55.

Nach der PA- und PT-Charakterisierung von synthetischem Hz sammelten wir Blutproben von C57BL/6-Mäusen, die intraperitoneal mit einem GFP-exprimierenden P. yoelii 17XNL infiziert waren. Transmissions- (Hellfeld-), Fluoreszenz- und PTM-Techniken wurden angewendet, um die einzelnen Zellen in mit Propidiumiodid (PI) gefärbten Blutproben abzubilden, um Parasiten in verschiedenen Entwicklungsstadien von frühen Ringen bis zu reifen Schizonten gezielt anzugreifen (Abb. 7). Während Transmissionsbilder kaum oder gar keine strukturellen Informationen über die Parasiten und Hz innerhalb von iRBCs lieferten, unterschieden fluoreszierende (FL) und konfokale PTM-Plattformen in Kombination deutlich PI-markierte Parasiten bzw. Hz zwischen autofluoreszierenden und Hb-assoziierten Absorptionshintergründen innerhalb von RBCs. Insbesondere zeigte die integrierte konfokale PTM- und konfokale FL-Mikroskopie sowohl Hz- als auch Parasiten-Co-Lokalisierung in P. yoelii-infizierten Maus-Erythrozyten mit guter Auflösung und hohem Bildkontrast. PTM ermöglichte die Visualisierung der intrazellulären Verteilung von Hz und ihrer Aggregate (Abb. 7b, c; Abb. S4c – e), die mit herkömmlicher Transmissionsmikroskopie nicht sichtbar sind (Abb. 7a). Innerhalb von 2 bis 4 Stunden nach der Invasion veränderte sich die Form der Erythrozyten von der traditionellen bikonkaven Scheibenform zu einer kleineren Kugelform. Im Trophozoitenstadium verbrauchten die Parasiten den Hb-Gehalt fast vollständig, was zur Bildung mehrerer Hz-Kristalle führte, die in Erythrozyten mit reduziertem oder sogar keinem Hb-Hintergrund im Vergleich zu nRBCs sichtbar waren (Abb. 7c, Abb. S4c). Nur PTM war in der Lage, die interzellulären Details des Parasitenfortschritts von den anfänglichen Ringstadien (Abb. 7a, b) bis zum Schizontenstadium zu überwachen, begleitet von der Freisetzung von Hz aus Erythrozyten ins Plasma (Abb. S4f). In einigen Blutproben konnten wir WBCs mit aufgenommenem Hz (Abb. 7d) im Vergleich zur Kontrolle ohne Hz (Abb. S4a) beobachten.

Die optischen Bilder der Kontrolle und der mit P. yoelii infizierten Zellen, gefärbt mit Propidiumiodid (PI). Spalte: Transmission (erste), Fluoreszenz (zweite), photothermische Mikroskopie (PTM) (dritte) und integrierte (vierte) Bilder von Mausblutzellen. (a) Frühes Ringstadium (2–4 Stunden nach der Infektion) mit einem einzelnen Parasiten im Erythrozyten ohne Anzeichen von Hz. (b) Trophozoitenstadium (6–10 Stunden nach der Infektion) mit einem einzelnen Parasiten im Erythrozyten mit einem oder wenigen Hz. (c) Ausgereiftes Schizontenstadium (24 Stunden nach der Infektion) mit vielen Parasiten und Hz. (d) Hz in Leukozyten ohne Anzeichen von Parasiten und Hz in Erythrozyten (24 Stunden nach der Infektion).

Unsere Studien zu Malaria bei Mäusen, sowohl in vivo als auch ex vivo, haben die Fähigkeit der neuartigen Rainbow-Plattform erfolgreich demonstriert, von Plasmodium abgeleitete Hz in Erythrozyten zu erkennen und aufzulösen. Deshalb haben wir das Rainbow-Zytophon als nächstes am menschlichen Krankheitserreger P. falciparum getestet. Gefrorene Proben des P. falciparum-Stammes 3D7 wurden mithilfe eines mehrstufigen etablierten Verfahrens aufgetaut (siehe Methoden)23,24,25,26. Die Parasitenkulturen wurden mit einer 5%igen Sorbitlösung synchronisiert, um nur Parasiten im Ringstadium 0 bis 12 Stunden nach der Infektion einzuschließen. Von den synchronisierten Kulturen wurden insgesamt neun Proben entnommen, einschließlich der folgenden Zeitpunkte nach der Erythrozyteninfektion: 0–4 h, 6–10 h, 12–16 h, 18–22 h, 24–28 h, 30–34 h, 36 –40 Std., 42–46 Std. und 48–52 Std.

In nicht infizierten Kontrollblutproben wurden keine Signale beobachtet (Abb. 5e). Unter Verwendung von in vitro kultivierten Parasiten erzeugte P. falciparum-induziertes Hz in iRBCs (Abb. 5f, g) größere PA-Signale als ex vivo P. yoelii-infizierte RBCs (Abb. 5b, d), was auf das vielversprechende klinische Potenzial von Cytophone für hinweist Malaria-Diagnose. Somit deuten Daten darauf hin, dass der Ersatz von Feststofflasern durch die kostengünstigeren und kleineren Mehrfarbenlaserdioden für die Erkennung von Malariaparasiten geeignet ist.

Um das Auftreten von P. falciparum-Parasiten in verschiedenen Stadien des Erythrozyten-Lebenszyklus zu untersuchen, verwendeten wir erneut Transmissions- (Hellfeld-), Fluoreszenz- und PTM-Techniken auf einzelne Zellen in Kulturproben in mit PI gefärbtem Blut (Abb. S5). Die Bilder wurden vor der Erythrozyteninvasion (a), kurz nach der Invasion (innerhalb von 4 Stunden) mit der Bildung einzelner und gruppierter Hz (b, c), reifer Stadien (24 Stunden nach der Infektion) mit mehreren Parasiten, wahrscheinlich Schizonten, und Hz (d ) und ein einzigartiger Fall eines freigesetzten Parasiten mit Hz im Inneren (e). Es sollte betont werden, dass wir Hz-Bildungsereignisse in den frühesten Stadien der Invasion (innerhalb von 4 Stunden) identifizieren konnten. PTM-Daten können auch in einer 3D-Simulation (Abb. S6) sowie als Video mit 3D-Rotation (Zusatzvideo) dargestellt werden, was eine genauere räumliche Lokalisierung von Hz mit hochauflösendem PTM ermöglicht. Die PT-Daten korrelierten gut mit der konventionellen Färbung von P. falciparum-Objektträgern zu verschiedenen Zeitpunkten von 0–4 h bis 48–52 h (Abb. S7).

In dieser Arbeit zeigen wir zum ersten Mal, dass unser zweifarbiges Zytophon mit fortschrittlichen Laserdioden das Potenzial für eine Weiterentwicklung als neuartige Diagnoseplattform für den Nachweis und die Identifizierung von Plasmodium-iRBCs sowie mehreren anderen damit verbundenen intrinsischen PA-Markern hat mit anderen Krankheiten von globaler Bedeutung. Wir haben gezeigt, dass ein Zytophon mit zwei kleinen Laserdioden (Wellenlängen: 808 nm und 915 nm) Hz, ein Nebenprodukt des Hämabbaus, das von allen bekannten Plasmodium-Arten erzeugt wird, vor einem Bluthintergrund und Artefakten identifizieren kann. Nicht infiziertes Blut lieferte PA-Spuren ohne vorübergehende scharfe PA-Peaks über dem Bluthintergrund (Abb. 4b, 5a, c, e), während Blut mit verschiedenen Plasmodium-Spezies infiziert war, einschließlich in vitro kultiviertem P. falciparum, der am weitesten verbreiteten und virulentesten menschlichen Spezies (Abb. 4d–f, 5b) zeigen deutlich die Möglichkeit einer zweifarbigen (z. B. 808 nm/915 nm oder 671 nm/820 nm) Identifizierung von Hz-assoziierten Peaks mit einem spezifischen PA-Signalverhältnis vor einem normalen Hintergrund Blut oder Artefakte mit anderen Verhältnissen und/oder typischerweise erzeugte Signale bei nur einer Wellenlänge. Die Absorptionsspektren von Hz zeigten eine allmählich abnehmende Absorption mit zunehmender Wellenlänge im NIR-Bereich mit einem leichten Maximum bei 670 ± 2 nm, während die RBC-Absorption in diesem Bereich leicht zunahm (z. B. 700–950 nm [Abb. 1c])32 . Quantitative Daten zur Parasitämie können erhalten werden, indem die Anzahl der PA-Signale pro Zeiteinheit (d. h. die Signalrate), die einzelnen iRBCs für eine bestimmte Zeit zugeordnet sind, gezählt wird, dividiert durch das Blutvolumen, das zur gleichen Zeit den Nachweispunkt passiert. Die Flussrate zur Berechnung eines Blutvolumens kann für ein untersuchtes Gefäß aus der Literatur15 grob geschätzt oder direkt mit US15 und/oder PA-Techniken9 gemessen werden.

Wir haben außerdem gezeigt, dass unsere Integration von PTM und PAFC den Nachweis winziger (ungefähr 100 nm) einzelner Hz-Nanokristalle ermöglichte, die sich nur wenige Stunden (4 Stunden) nach der Invasion der Erythrozyten durch Parasiten (Merozoiten) bildeten, sowie von Hz-Aggregaten (Abb . 7, S4-6). Mit herkömmlichen Nachweistechniken ging man davon aus, dass Hz bis zu 24 Stunden lang erst nach 12 Stunden oder länger nachweisbar ist. Nur magnetooptische (MO) Methoden haben gezeigt, dass sie die Hz-Bildung innerhalb von 6 bis 10 Stunden erkennen können46. Darüber hinaus wird laut einer aktuellen Analyse47 die Geschwindigkeit der In-vivo-Kristallisation, ein wichtiger Schritt in der Hz-Biosynthese, auf 7.000 Häm/s geschätzt. Wenn man berücksichtigt, dass es in einem einzelnen Hz etwa 6 bis 10 Millionen Häme gibt, könnte die Bildung von Hz theoretisch bereits 15 bis 24 Minuten nach der Invasion beginnen. Wenn unsere Daten den Zeitpunkt der Hz-Bildung in iRBCs verschieben, müssen wir möglicherweise die Physiologie des frühen Parasitenwachstums unmittelbar nach der Invasion sowie den potenziellen Nutzen fortschrittlicher PTM- und Cytophone-Plattformen überdenken, um die Dynamik von Hz über die gesamten 48 zu verstehen -h Lebenszyklus. Wir gehen davon aus, dass das Zytophon möglicherweise das Potenzial hat, Malaria frühzeitig im Verlauf einer Infektion im Blutstadium zu diagnostizieren14,15 sowie bei geringen Parasitendichten, und dass es möglicherweise auch für Arzneimittelwirksamkeits- und Lebensfähigkeitsstudien in vivo nützlich sein könnte23.

Wir fanden heraus, dass die Lebensdauer von Hz im Blutkreislauf relativ lang ist (bis zu 24 Stunden vor seiner nennenswerten Clearance durch das retikuloendotheliale System ohne Signalverschlechterung) (Abb. S2), während andere Wirkstoffe (z. B. Melanin-NPs, Melanomzellen, Farbstoffe usw.) Bakterien) werden in der Regel in viel kürzerer Zeit (10 Minuten bis einige Stunden) beseitigt9. Biologisch erzeugte Hz-Kinetiken wurden bei muriner und menschlicher Malaria untersucht und haben gezeigt, dass Hz, sobald es freigesetzt wird, schnell phagozytiert wird, wobei intrazelluläres Hz in diesen Phagozyten vorhanden ist, bis sie den Kreislauf verlassen. Insbesondere ermöglicht unsere integrierte multimodale PAFFC-Plattform die Identifizierung des Parasiten und der Hz-Position in iRBCs durch zeitliche Koinzidenz entsprechender Signale oder extrazellulär im Plasma durch das Vorhandensein einzelner Signale von Hz (Abb. 4g, 5d)14. Wir glauben, dass dieselbe Plattform für die Identifizierung von Hz in Monozyten und Neutrophilen nach dem Bruch von iRBCs nach dem Schizonten verwendet werden kann, was anschließend zur Freisetzung von freiem Hz im Plasma und dessen anschließender Verschlingung durch Phagozyten führt (Abb. 7d). Insbesondere Neutrophile und Monozyten können durch Markierung mit Antikörpern gegen CD11- bzw. CD15-Marker oder in Kombination identifiziert werden. Während diese Anwendungen für Tiermodelle vorgesehen sind, besteht die Hoffnung, dass in Zukunft konjugiertes ICG oder Goldnanopartikel mit geringer Toxizität, die für eine Pilotstudie am Menschen zugelassen sind20, zur Lokalisierung von Hz in verschiedenen Gefäßkompartimenten verwendet werden können. Darüber hinaus wollen wir diese Daten nutzen, um die PAFC-Kapazität in vivo zu optimieren und intraerythrozytische Hz von freien Hz und phagozytierten Hz zu unterscheiden. Andererseits dauert die Entfernung von freiem Hz aus dem Verkehr nur wenige Tage48, was das Risiko einer falschen Positivität minimiert.

Wie bereits erwähnt, kann die Cytophone-Plattform mithilfe eines räumlich abtastenden Laserstrahls die räumliche Verteilung von an der Gefäßwand haftenden iRBCs identifizieren. Obwohl es sich bei unseren Daten um vorläufige Daten handelt, gehen wir davon aus, dass es sich hierbei um ein bekanntes Phänomen handelt, das für die Pathogenese der Malaria, insbesondere bei P. falciparum, von zentraler Bedeutung ist und als Sequestrierung bekannt ist. Die Sequestrierung von iRBCs erfolgt im peripheren Gefäßsystem sowie in mehreren Geweben, und obwohl dies ausführlich in Post-Mortem-Studien an Mäusen und Menschen beschrieben wurde, haben begrenzte Daten gezeigt, dass solche Prozesse in vivo ohne Verwendung von Markierungen ablaufen. Weitere Arbeiten in diesem Bereich sind im Gange, einschließlich des Vergleichs der Ergebnisse der iRBC-Zahlen in Venen und Arterien15.

Am entscheidendsten für die weitere Entwicklung der neuartigen Cytophone-Plattform wäre vielleicht die Fähigkeit des Geräts, zwischen Plasmodium-Arten zu unterscheiden. Da verschiedene Arten leicht unterschiedliche Absorptionsspektren aufweisen können, ist es möglicherweise möglich, durch Auswahl der richtigen Laserwellenlänge zwischen Plasmodium-Arten zu unterscheiden. Darüber hinaus produzieren verschiedene Arten unterschiedliche Hz-Nanokristallgrößen und -formen . Da die Form der PA-Signalwellenform von der Zielgröße abhängt2,3, kann dies eine weitere Möglichkeit sein, verschiedene Arten zu identifizieren. Obwohl wir das neue Zytophon noch nicht an verschiedenen menschlichen Malariaarten getestet haben, belegen unsere Daten schlüssig die Fähigkeit von PAFC, die wichtigste menschliche Art, P. falciparum, zu erkennen. Tatsächlich schienen die erzeugten Signale robuster zu sein als die von ex vivo-Proben von murinen P. yoelii. Wir gehen davon aus, dass der PAFC in der Lage sein wird, alle Arten zu erkennen, wie andere Hz-basierte Geräte gezeigt haben, und weitere Studien sind im Gange, um Arten anhand der oben genannten Parameter zu unterscheiden.

Das Regenbogen- (d. h. mehrfarbige) Zytophon verfügt über multispektrale Laserdioden mit vielen derzeit verfügbaren diskreten Wellenlängen im Bereich von 630 bis 1650 nm sowie einen zeitlich farbcodierten Modus9,19,20, der einzigartige Möglichkeiten für Mehrfarben (bis zu 30–30 nm) eröffnet. 40 Farben gleichzeitig) In-vivo-Durchflusszytometrie mehrerer Ziele. Obwohl wir diese neue Plattform in dieser Studie auf Malaria angewendet haben, sind die erhaltenen Daten (z. B. Abb. 3, 4, 5, S3) sowie unsere zuvor veröffentlichten Ergebnisse mit konventionellen Lasern9,12,16,17,18, 19,20,21,43,44,45,46,49 weisen darauf hin, dass unsere Cytophone-Plattform mit Laserdioden von nur wenigen mm Größe ein gewisses Potenzial für die markierungsfreie Diagnose von Melanomen, Bakteriämie und Sichelzellenanämie (z. B , Hämoglobinopathien), Schlaganfall, COVID-19-bedingte Komplikationen (z. B. Blutgerinnung), verschiedene Formen von Hb, einschließlich Oxy-, Desoxy- und Metha-Hb (Methämoglobinämie)19 und einige Bluterkrankungen, die mit unzureichendem Sauerstofftransport und Thalassämie einhergehen. Obwohl Laserdioden im Vergleich zu Feststofflasern im Durchschnitt eine geringere Pulsenergie haben, gleicht die hohe Empfindlichkeit des Zytophons zusammen mit fortschrittlicher Software und Signalverarbeitungsalgorithmen diese Einschränkung zumindest teilweise, wenn nicht vollständig aus. Darüber hinaus werden Fortschritte bei der Entwicklung leistungsstarker Laserdiodenarrays mit Pulsenergien von bis zu 1 bis 2 mJ37 die Auswirkungen dieser Einschränkung für klinische Anwendungen deutlich verringern. Während sich die hier vorgestellten In-vivo-Daten weitgehend auf Malaria bei Mäusen beschränken, haben uns unsere vielversprechenden In-vitro-Daten zu P. falciparum dazu veranlasst, eine erste Pilotstudie am Menschen mit dem Regenbogenzytophon zu initiieren. In weiteren Arbeiten wird die Fähigkeit von Cytophone untersucht, Plasmodien von anderen erythrozytären Krankheitserregern wie Babesia und Bartonella zu erkennen/unterscheiden. Dies wird unserer Meinung nach gelingen, da keines der beiden letztgenannten bekanntermaßen Hämozoin produziert.

Wir haben zuvor gezeigt, dass PA-Signale (mit typischen Breiten von 0,2–0,3 µs) eine gut unterscheidbare akustische Zeitverzögerung (0,5–2 µs) von zirkulierenden Objekten in Blutgefäßen aufweisen, die vom Schallkopf über der Haut im Vergleich zum Hintergrund erfasst werden PA-Signale aus der pigmentierten Hautschicht21. Der zeitaufgelöste Erkennungsmodus in Cytophone ermöglichte es uns daher, den Einfluss des Hautpigmentierungshintergrunds auf die PAFC-Empfindlichkeit zu eliminieren. Mit anderen Worten: Dieser Modus sorgt zusammen mit schnellen Signalverarbeitungsalgorithmen dafür, dass PA-Daten gegenüber Hautpigmentierung tolerant sind. Wir verwendeten zusätzlich sowohl ein In-vivo-Tier- (Abb. 4a) als auch ein Gefäßphantommodell, bestehend aus Kunststoffschläuchen und Hautphantomen38 mit einer Melaninschicht auf der Oberfläche des Phantoms, um den Einfluss der Hautschicht auf die PAFC-Messwerte zu beurteilen.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass ein Zytophon mit multispektralen, zeitlich farbcodierten Pulslaserdioden und zeitaufgelöster Hochgeschwindigkeitssignalverarbeitung die bisherigen Einschränkungen von PA-Techniken, insbesondere PAFC, die mit der Verwendung von Feststofflasern aufgrund der technischen Komplexität verbunden sind, überwindet. große Größe, hohe Kosten und eine einzige Wellenlänge, die in den meisten Anwendungen verwendet wird. Unsere vorläufigen Ergebnisse zeigen die Machbarkeit eines tragbaren, möglicherweise batteriebasierten Zytophons mit Laserdioden. Das Zytophon kann die Blutzirkulation kontinuierlich in Echtzeit überwachen oder regelmäßig untersuchen, um das Auftreten der Parasiten innerhalb weniger Stunden nach der Invasion zu erkennen. Die Zytophontiefe liegt deutlich innerhalb der dokumentierten Möglichkeiten herkömmlicher In-vivo-PA-Bildgebungstechniken zur Beurteilung relativ tiefer menschlicher Blutgefäße (bis zu 3–5 cm)2,3,4,5,6,7,8,9. Allerdings sind diese Techniken, die Mikroskopie- und Tomographieplattformen verwenden, relativ langsam, was es schwierig macht, sich schnell bewegende (3–10 cm/s selbst in 1 mm tiefen Gefäßen), zirkulierende iRBCs und andere Ziele zu erkennen, insbesondere in tiefen, großen Gefäßen. Unsere früheren Daten mit Festkörperlasern mit hoher Pulswiederholung und jetzt mit Laserdioden legen nahe, dass die PAFC-basierte Cytophone-Plattform mit akustischer Auflösung eine Hochgeschwindigkeitserkennung und spektrale Identifizierung von zirkulierenden Objekten unterschiedlicher Herkunft in relativ tiefen Tiefen (1–2 cm) ermöglichen kann große (4–6 mm) Blutgefäße mit Strömungsgeschwindigkeiten von bis zu 10–20 cm/s9,12,21. Die einzigartige Fähigkeit, solche Gefäße abzufragen und gleichzeitig auf den Prozess der Hz-Bildung zu zielen, der für alle Plasmodienarten von zentraler Bedeutung ist, verspricht eine sehr schnelle, nichtinvasive und markierungsfreie Malariadiagnose für alle Arten. Durch die Möglichkeit, größere Mengen an zirkulierendem Blut zu untersuchen, kann die Zytophon-Sensitivität außerdem die Erkennung des großen Reservoirs an asymptomatischen Personen ermöglichen, ein Fortschritt, der sowohl zu einer verbesserten Malariakontrolle als auch zu ihrer letztendlichen Eliminierung beitragen könnte. Darüber hinaus gehen wir durch die Verknüpfung der Daten aus dieser Studie mit unserer früheren PAFC-Arbeit davon aus, dass die mehrfarbige Cytophone-Plattform die Erkennung und Identifizierung mehrerer Krankheiten ermöglichen könnte, was sie zu einem vielversprechenden tragbaren, nicht-invasiven Werkzeug in einem breiten Spektrum globaler Umgebungen macht.

Der mehrfarbige PAFC-basierte Cytophone-Aufbau (Abb. 1a, 2a – c) ist mit zwei gepulsten Laserdioden (MM25004, MM25005, Quantel Laser, Frankreich) mit Wellenlängen von 808 nm und 915 nm (Abb. 2c) und Pulsbreiten von ausgestattet 27 ns, Pulswiederholungsrate von 1 bis 3 kHz und Pulsenergien von 140 μJ bzw. 110 μJ. Jeder Laser verfügt über 20 Emitter mit einer Gesamtlänge von 5 mm und einer einzelnen Emittergröße von 8 × 200 µm. Beide Laserdioden hatten Ausgangsdivergenzwinkel von 40 Grad für die sogenannte „schnelle Achse“ und 10 Grad für die „langsame Achse“ ohne zusätzliche optische Komponenten37,38 .. Um den Divergenzwinkel in Richtung der schnellen Achse auf etwa 2 Grad zu verringern und Um die Laserstrahlung zu kollimieren, wurden Fast-Axis-Collimator-Linsen (FAC) mit einer Brennweite von jeweils 260 μm und einem Durchmesser von 400 μm hinzugefügt. Zwei Spiegel wurden verwendet, um die Laserstrahlung in die gleiche Ausbreitungsrichtung zu bündeln. Der eine Spiegel war aus Silber (PF10-03-P01, Thorlabs Inc), um die 808-nm-Diodenlaserstrahlung zu reflektieren und schließlich mit der 915-nm-Laserdiode unter Verwendung eines dichroitischen Spiegels (Di02-R830-25 × 36, Semrock, IDEX Health & Science, GMBH). Die kombinierten Laserstrahlen wurden durch eine sphärische Linse (LA1274-B, Brennweite 40 mm, Thorlabs Inc.), gefolgt von einem asphärischen zylindrischen Kondensor (ACL2520-B, Brennweite 20 mm, Thorlabs Inc.), weiter in den fokussierten linearen Strahl umgewandelt .). Die endgültige Laserstrahlgröße betrug 1,8 mm × 65 μm und wurde periodisch mit einer CMOS-Kamera (DCC1645C-HQ, Thorlabs, Inc.) gesteuert. Die Pulsenergien nach Austritt aus dem optischen System wurden auf 80 μJ eingestellt, was für unsere Anwendung ausreichend war. Die Laserenergie wurde mit einem optischen Leistungsmesser PM100USB, S314C-Sensor (Thorlabs, Inc.) gesteuert.

Laserinduzierte akustische Wellen in den Proben wurden mit einem speziell angefertigten fokussierten zylindrischen Wandler (Zentralfrequenz: 51,1 MHz, Brennweite 6 mm, laterale akustische Auflösung von 65 μm) erfasst. Der Wandler wurde auf einem unabhängigen XYZ-Positionierungstisch befestigt, um eine mikrometergenaue Einstellung seiner Position zu ermöglichen. Der unabhängige Z-Tisch wurde verwendet, um die optische Linse in Z-Richtung anzupassen, um die PA-Signalamplitude zu maximieren. Um gleiche PA-Signale von beiden Laserdioden zu erhalten, haben wir zunächst die Energien für beide Laserdioden ausgeglichen und dann den unabhängigen Z-Tisch verwendet, um die Probe an optimale Punkte für die akustischen und optischen Fokusse anzupassen, indem wir den Tisch in Z-Richtung bewegten. Dadurch wurden gleiche maximale PA-Signale von Objekten mit ähnlicher Absorption (z. B. schwarzes Klebeband) auf beiden Wellenlängen der Laserdiode erreicht. Zur akustischen Kopplung wurde herkömmliches Ultraschallgel verwendet. Ein Standardimpulsgenerator wurde verwendet, um ein Signal zum Antreiben der Laserdioden zu erzeugen, und ein daraus resultierendes synchronisiertes Signal wurde an die Datenerfassungsplatine (ATS9350, Alazar Technologies, Inc., Kanada) gesendet. Die PA-Signale wurden durch einen Vorverstärker (AH-2010–100, Precision Acoustics Ltd, Vereinigtes Königreich) verstärkt.

Die Prinzipien der PAFFC-Integration von PAFC- und FFC-Modulen wurden an anderer Stelle ausführlich beschrieben14. Kurz gesagt, der Aufbau wurde auf einer Nikon Eclipse E400-Mikroskopplattform (Nikon Instruments Inc., USA) mit drei Nanosekundenlasern (0,6–8 ns) mit hoher Pulswiederholungsrate (1–10 kHz) und den entsprechenden Wellenlängen von 532 nm, 671, aufgebaut nm, 820 nm, 1060 nm und 1064 nm für die PA-Detektion und mit einer CW488-nm-Laserdiode für die Fluoreszenzdetektion. Wir verwendeten einen Yb-Faserlaser YLPM-0.3-A1-60–18 (IPG Photonics Corp.), der mit einer Wellenlänge von 1.060 nm, einer Pulsfrequenz von 1 bis 10 kHz und einer Pulsbreite von 0,8 bis 10 ns arbeitete. Die Laserenergie wurde mit einem Leistungsmesser (PM100USB, S314C-Kopf, Thorlabs, Inc.) gesteuert. Die Signale vom Fotodetektor (PDA10A, 150 MHz, Thorlabs, Inc.) lösten die Datenerfassungshardware aus. Um den Laserstrahl in eine schmale Linie (6,5 μm × 780 μm) zu formen, die das Phantom oder echte Blutgefäß in einem Tiermodell kreuzt, verwendeten wir eine Kombination aus asphärischen (C560TME-C) und zylindrischen (LJ1598-L1-C) Linsen ( Thorlabs, Inc.).

Laserinduzierte akustische Wellen wurden von maßgeschneiderten zylindrisch fokussierten Ultraschallwandlern mit einem 28 µm dicken, druckempfindlichen Polyvinylidenfluorid-Element mit einem Breitbandfrequenzgang im Bereich von 0,2 bis 32 MHz und einer Brennweite von 6 mm erfasst. Der Wandler wurde auf einem XYZ-Tisch montiert, um eine präzise Positionseinstellung zu ermöglichen. Ein PC wurde verwendet, um Wandlersignale aufzuzeichnen, die durch einen Verstärker (Modell 5662B, 50 kHz – 4 MHz, Panametrics) verstärkt wurden. Eine Analog-Digital-Wandlerplatine sowie die Software LabVIEW und MATLAB ermöglichten es dem Setup, die Signale zu sammeln. Fluoreszenzsignale von der Photomultiplier-Röhre wurden mit einer Rate von 4 MHz abgetastet und auf 10 kHz heruntergesampelt, mit einem Durchschnitt von 400 Punkten. Zur Analyse beider Signale wurde eine maßgeschneiderte Software verwendet, die als Signalspuren mit dem Zeitpunkt des Auftretens, den Amplituden, Formen und Breiten für jeden Peak oberhalb des Hintergrundpegels angezeigt wurde.

Das allgemeine Prinzip des PTM-Systems wurde an anderer Stelle ausführlich beschrieben34,35,36. Kurz gesagt, die technische Plattform der kollinearen konfokalen Zweistrahl-PTM-Bildgebung (Pump-Probe) basierte auf einer IX73-Mikroskopplattform (Olympus America, Inc., Central Valley, PA) mit unterschiedlichen Hochpulsraten (1–10 kHz). , Nanosekundenlaser (5–10 ns) mit festen Wellenlängen (532/671/820/1064 nm), die eine Kombination aus Linse und Faseroptik verwendeten, um Laserlicht auf Proben zu übertragen. Dies wurde mithilfe eines 3-Wellenlängen-Wellenlängenmultiplexers (WDM-RGB46HF, Thorlabs, Newton, NJ) erreicht, der die Strahlen eines 473-nm-CW-Lasers (zur Fluoreszenzanregung), 532-nm-CW- und Pulslaser (für PT-Pumpen und Fluoreszenz) kombinierte Anregung) und 635 nm CW-Laser (PT-Sonde) in eine Singlemode-Faser. Abhängig von der Anwendung ermöglicht dieses Schema dem Benutzer, für die PT-Bildgebung zwischen gepulsten und CW-Pumplaserquellen zu wechseln, ohne die Systemausrichtung zu beeinträchtigen. Zunächst verwendeten wir herkömmliche Pumpschemata mit einem CW-Laser, der bei 532 nm arbeitete. Die Laserintensität wurde unter Verwendung eines elektrooptischen Modulators (EOM-NR-C4, Thorlabs, Newton, NJ) bei einer Frequenz von 100 kHz moduliert. PT-Phänomene, die aus der Absorption von Pumplaserlicht resultieren, wurden durch Modulation der Sondenstrahlintensität mithilfe einer Fotodiode mit Lock-in-Verstärker (SR530, Stanford Research Systems, Sunnyvale, CA) nachgewiesen. Zweitens wurde ein gepulster 532-nm-Laser (Modell LUCE 532; Pulsbreite 5 ns; Pulsfrequenz 10–30 kHz; Bright Solutions, Italien) verwendet, um lineare und nichtlineare PT-Effekte in der Probe zu induzieren. Die Intensität dieses Lasers wurde über denselben elektrooptischen Modulator moduliert, um die Pulsenergie zwischen den Pulsen schnell zu ändern, wobei PT-Signale als Rückmeldung genutzt wurden, um Probenschäden zu verhindern. Um eine konfokale PT-Konfiguration bereitzustellen, wurde eine Fotodetektorlochblende auf einer Ebene positioniert, die einen Rayleigh-Bereich von der „Taillenebene“ des Sondenstrahls entfernt lag. Somit ermöglicht die Lochblende die Erkennung stark lokalisierter thermischer Linseneffekte innerhalb einzelner absorbierender Ziele und eliminiert gleichzeitig den Einfluss von unscharfen PT-Signalen. Für die 3D-Bildgebung wurden aufeinanderfolgende PT-Bilder auf parallelen x-y-Ebenen aufgenommen, die entlang der z-Achse verteilt waren. Um PT-Daten zu validieren und das System universeller zu machen, haben wir PTM mit PA-, Transmissions- und Fluoreszenzmethoden integriert, indem wir konfokales PTM mit konfokalen Fluoreszenzmikroskopmodulen und derselben Lochblende für die räumliche Auswahl von Fluoreszenz- und Sondenstrahlen sowie multimodaler PT-Fluoreszenz verwendet haben Kontrastmittel. Insbesondere wurde das Fluoreszenzmodul zur Erfassung von Zellautofluoreszenz und laserinduzierter Fluoreszenz von Zytoplasma und Membran-P. yoelii 17X GFP + infizierten Erythrozyten (unter Verwendung eines 575/15-nm-Kanals mit einem 532-nm-Anregungslaser) verwendet.

In dieser Studie wurde ein JSM-7000F SEM (JEOL USA, Peabody, MA) mit einer Feldemissionselektronenkanone verwendet, ausgestattet mit einem EDS-System (EDAX Inc, Mahwah, NJ). Für die SEM-Bildgebung wurden zwei Probenvorbereitungsmethoden verwendet: 1) Trockenpulver aus Hz-Kristallen wurde in Ethanollösung suspendiert. Einige Tropfen der Suspension wurden auf eine 12,2 (Durchmesser) × 10 mm (Dicke) große Aluminiumscheibe (Ted Pella, Inc, Redding, CA) aufgetragen und 2) das gleiche trockene Pulver wurde auf ein mit Löchern versehenes, mit Kohlenstoff beschichtetes TEM gestreut Gitter (SPI Supplies, West Chester, PA). TEM-Bilder wurden mit einem JEM-2100F mit einer Feldemissionselektronenkanone (JEOL USA, Peabody, MA) aufgenommen, das auch mit einem EDAX EDS-System ausgestattet war. Hz-Kristalle wurden in Ethanol suspendiert und vorsichtig durch leichtes Schütteln dispergiert. Einige Tropfen der Hz-Suspension wurden auf löchrigen, mit Kohlenstoff beschichteten 200-Mesh-Kupfer-TEM-Gittern (SPI Supplies, West Chester, PA) abgeschieden. Diese Gitter wurden vor der TEM-Analyse eine Stunde lang getrocknet.

Die Tiere wurden gemäß einem vom Institutional Animal Care and Use Committee der University of Arkansas for Medical Sciences (UAMS) genehmigten Protokoll verwendet. Die weiblichen C57BL/6- und Foxn1(nu/nu)-Mäuse (The Jackson Laboratory, Inc.) wurden mittels intraperitonealer Injektion mit 105 im Blutstadium Plasmodium yoelii 17XNL GFP+ parasitierten Erythrozyten infiziert. Als Negativkontrollen dienten nicht infizierte C57BL/6-Mäuse. Während der Experimente wurden die Mäuse durch Inhalation von 1,2 % Isofluran anästhesiert und zur In-vivo-Überwachung auf dem Rücken auf einen auf 37 °C beheizten Tisch gelegt. Die für die Studie ausgewählten Gefäße hatten einen Durchmesser von etwa 50 bis 70 µm und befanden sich in einer Tiefe von 150 bis 200 µm im Mausohr. Die Wandler und optischen Spitzen wurden am Erkennungspunkt sanft über der Haut platziert und in Echtzeit angepasst, indem die Ausrichtung für maximale und stabile PA-Signale optimiert wurde. Zur akustischen Kopplung zwischen Schallkopf und Haut wurde Ultraschallgel (Aquasonic Clear, Parker Labs, Inc.) verwendet. Aus Schwanzgefäßen wurde Mäuseblut für In-vitro-Tests mittels Giemsa-Färbung dünner Blutausstriche und Fluoreszenzmikroskopie gesammelt. Für PAFFC (oben) haben wir Blut aus der Baucharterie und der Seitenvene des Schwanzes anästhesierter Mäuse mit einer 28G-Nadel und einer 1-cm³-Spritze mit Natriumcitrat als Antikoagulans gesammelt. Es wurden Blutausstriche hergestellt und dann auf Objektträgern untersucht, indem Blutproben von gesunden und infizierten Mäusen verwendet, mit 100 % Methanol fixiert und an der Luft getrocknet wurden. Die Mäuse wurden mit den GFP-exprimierenden Parasiten infiziert, während die nicht infizierten Mäuse als Kontrolle dienten. Die Anzahl der PA-Signale pro Sekunde wurde analysiert, um das Blutparasitenstadium abzuschätzen.

In ausgewählten Experimenten wurde menschliches Blut von Freiwilligen gemäß den vom Institutional Review Board der Yale University genehmigten Protokollen verwendet. Von allen Probanden wurde eine Einverständniserklärung eingeholt. Alle Methoden wurden in Übereinstimmung mit den relevanten Richtlinien und Vorschriften durchgeführt. Die Studie wurde in Übereinstimmung mit den ARRIVE-Richtlinien durchgeführt.

Die In-vitro-PA-Detektion von fließenden lichtabsorbierenden Objekten wurde an einem selbst konstruierten dynamischen Blutflussgefäßphantom durchgeführt38,39. Dieses bestand aus Polyvinylchlorid-Plastisol mit TiO2-Nanopartikeln, die Biogewebe mit angemessenen Streu- und Absorptionseigenschaften modellieren, einer Melaninschicht, die pigmentierte Haut darstellt, Glas- und Kunststoffröhren mit unterschiedlichen Durchmessern und Tiefen sowie einem Strömungsmodul zum Pumpen bewegter Objekte mit Geschwindigkeiten zwischen 0,5 und 5 cm /S. Insbesondere ein zylindrisches Glasrohr mit einem Durchmesser von 0,78 mm (Sutter Instrument, BF100-78–10), das als Blutgefäß mit einer Tiefe von 0,5 bis 2 mm fungiert, modellierte die typische medizinische Anwendung von PAFC. Um fließende Zellen und Partikel nachzuahmen, verwendeten wir 1) Magnetkügelchen mit unterschiedlichen Größen und spezifischer Absorption im NIR-Bereich (Abb. 1c); 2) rote Blutkörperchen, die Erythrozytenaggregate im Blut darstellen; 3) 100 µm transparente Silikatkügelchen als weiße CBCs-Phantome; 4 ICG-Aggregate absorbieren bevorzugt bei 808 nm; und 5) im Handel erhältliches Hz. Insbesondere wurde eine synthetische Hz-Suspension in PBS-Lösung in Konzentrationen von 10 µg/ml, 1,0 µg/ml und 0,1 µg/ml als Phantom für Pigmenthaut und iRBCs verwendet. Die Hz-Suspension in PBS wurde aus einer Stammsuspension von 5 mg/ml durch Zugabe von 1 ml PBS zu 5 mg Hz-Kristallen im Originalfläschchen gemäß den Anweisungen des Herstellers (Invivo Gen) gewonnen. Zur Kalibrierung des PAFC-Systems wurde die Spur auch nach Verabreichung von Magnetkügelchen (Spherotech Inc.) mit unterschiedlichen mittleren Durchmessern überwacht. Das gleiche Volumen (2 µL) der Magnetkügelchen-Suspension (1 % w/v verschiedener mittlerer Partikelgrößenverteilungen: 5,25 µm, 8,22 µm und 23,7 µm) wurde in 8 ml PBS suspendiert.

Studien an Mäusen. Mithilfe der PAFFC-Plattform haben wir versucht, native Hz ex vivo frühzeitig mit der nichttödlichen Nagetierart Plasmodium Spezies P. yoelii 17XNL (MR4, BEI Resources Repository) zu erkennen. Um eine sekundäre Überprüfung der Ex-vivo-Echtzeit-Hz-Erkennung zu ermöglichen, wurde eine mit grün fluoreszierendem Protein (GFP) markierte Parasitenlinie (P. yoelii 17XNL:PyGFP) verwendet, die die Nutzung eines Fluoreszenzkanals in der PAFFC-Plattform ermöglichte. Infiziertes Blut einer Foxn1(nu/nu)-Maus, das 3 bis 4 Stunden nach der Infektion entnommen wurde, wurde gleichzeitig mit dem PAFFC-Verfahren und durch mikroskopische Untersuchung eines dünnen Blutausstrichs analysiert. Konkret wurden 100 µL einer mit GFP+ P. yoelli infizierten Blutprobe in einem Heparinröhrchen in 100 µL RPMI 1640-Medium verdünnt. Eine 1-µL-Probe dieser Lösung wurde in den folgenden Verhältnissen 1:102, 1:103, 1:104 und 1:105 seriell in PBS verdünnt und jede verdünnte Probe wurde durch PAFFC mit einem gepulsten Laser bei 671 nm analysiert PA-Anregung und ein CW-Laser bei 473 nm zur Fluoreszenzanregung.

Gefrorene Proben von P. falciparum (Laborstamm 3D7) wurden unter Verwendung eines mehrstufigen Kochsalzlösungsverfahrens (BEI Resources, Manassas, VA) aufgetaut. Platten von P. falciparum wurden in kontinuierlicher Kultur bei 2 % Hämatokrit mit menschlichen Erythrozyten gehalten und bei 37 °C in ergänztem RPMI 1640-Medium unter einer Atmosphäre mit 5 % Kohlendioxid und 1 % Sauerstoff inkubiert. Sobald die Parasitenkulturen > 5 % Parasitämie erreichten, wurden sie mit einer 5 %igen Sorbitlösung synchronisiert, um nur 0 bis 12 Stunden nach der Infektion Ringstadium-Parasiten einzuschließen. Diese Kulturplatten wurden überwacht, bis die Parasiten das späte Schizontenstadium erreichten. Zu diesem Zeitpunkt wurde ein 60 %iger Percoll-Gradient verwendet, um die Parasiten im Schizontenstadium abzutrennen. Die gesammelten Schizontenparasiten wurden wieder in eine neue Kulturplatte mit nicht infizierten menschlichen Erythrozyten eingeführt und 4 Stunden lang inkubiert. Diese P. falciparum-Kulturen wurden mit einer 5 %igen Sorbitlösung synchronisiert, um Platten zu erzeugen, die nur Parasiten im Ringstadium 0 bis 4 Stunden nach der Infektion enthielten. Die synchronisierten P. falciparum-Kulturen wurden für die nächsten 48 Stunden überwacht, wobei alle 6 Stunden eine serielle Probenahme der Kultur durchgeführt wurde, um dünne und dicke Blutausstrich-Mikroskopieobjektträger für die Analyse vorzubereiten. Von den synchronisierten Kulturen wurden insgesamt neun Proben entnommen, einschließlich der folgenden Zeitpunkte nach der Erythrozyteninfektion: 0–4 h, 6–10 h, 12–16 h, 18–22 h, 24–28 h, 30–34 h, 36 –40 Std., 42–46 Std. und 48–52 Std.

Die Mäuse wurden je nach Parasitämiestadium alle 1 bis 3 Tage von 10 Minuten bis 1 Stunde in vivo überwacht. Die PA-Signalrate wurde als Anzahl der Signale pro Zeiteinheit (Sekunde oder Minute) berechnet. Um die Datenschwankungen aufgrund der Gefäßgröße, der Position der täglichen Überwachung sowie der Mausindividualität auszugleichen, wurden ähnliche Gefäße mit einem Durchmesser von ~ 50 µm im Mausohr ausgewählt und verwendet. Anschließend wurden die Spitze-zu-Spitze-Amplituden der PA-Wellenformen verfolgt und die Punkte, die mindestens 3σ über den Hintergrundpegeln lagen, als PA-Signale betrachtet. Alle Messungen wurden mindestens dreimal durchgeführt und die Durchschnittswerte für alle diese Datenpunkte wurden in den Abbildungen aufgetragen. Die gesammelten Daten (M-Zählungen) wurden als M ± SD aufgetragen. Signal- und statistische Analysen wurden in MATLAB (MathWorks, Inc.) durchgeführt. Die Mittelung der gesammelten Daten mit Standardfehlerbalken wurde berechnet und zum Vergleich wurde ein Signifikanzniveau von α = 0,05 verwendet.

Alle mit dieser Studie verbundenen Daten sind in der Arbeit oder den ergänzenden Materialien enthalten.

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Referenzen herunterladen

Diese Arbeit wurde teilweise durch die UAMS-Stiftungsfonds unterstützt. Wir danken I. Pelivanov (Univ. of Washington) für die Bereitstellung der maßgeschneiderten fokussierten zylindrischen und sphärischen Wandler. Wir danken Amy Bei (Yale School of Public Health) für ihre Unterstützung bei der P. falciparum-Kultur und den Synchronisationsprotokollen. Der Plasmodium yoelii-Stamm 17XNL:PyGPF wurde von BEI Resources, NIAID, NIH, MRA-817 erhalten, bereitgestellt von Ana Rodriguez. Wir danken Sergey Nikitin für seine Hilfe beim ersten Testen von Laserdioden. Die meisten experimentellen Arbeiten wurden an der UAMS und teilweise an der Yale University durchgeführt. Nach Abschluss dieser Arbeit wechselte HJJ ​​an die Fakultät für Physik der Universität Bagdad, Al-Jadriya, Bagdad, Irak.

Die folgenden Autoren trugen gleichermaßen bei: Hind J. Jawad und Aayire C. Yadem.

Diese Autoren haben diese Arbeit gemeinsam betreut: Sunil Parikh und Vladimir P. Zharov.

Zentrum für integrative Nanotechnologiewissenschaften, University of Arkansas at Little Rock, 2801 S. University Ave., Little Rock, AR, 72204, USA

Hind J. Jawad, Aayire C. Yadem, Fumiya Watanabe und Alexandru S. Biris

Arkansas Nanomedicine Center, University of Arkansas for Medical Sciences, 4301 W. Markham St., Little Rock, AR, 72205, USA

Hind J. Jawad, Aayire C. Yadem, Yulian A. Menyaev, Mustafa Sarimollaoglu, Dmitry Nedosekin und Vladimir P. Zharov

Fakultät für Physik, Universität Bagdad, Al-Jadriya, Bagdad, 10071, Irak

Hind J. Jawad

Yale School of Public Health, 60 College St, New Haven, CT, 06520, USA

Jillian N. Armstrong und Sunil Parikh

Abteilung für Mikrobiologie und Immunologie, University of Arkansas for Medical Sciences, 4301 W. Markham St., Little Rock, AR, 72205, USA

Jason S. Stumhofer

College of Medicine, University of Arkansas for Medical Sciences, Little Rock, AR, 72205, USA

Dmitri Nedosekin

Abteilung für Hals-Nasen-Ohrenheilkunde, College of Medicine, University of Arkansas for Medical Sciences, Little Rock, AR, 72205, USA

James Y. Suen und Vladimir P. Zharov

CytoAstra, LLC, 401 South Cedar St., Little Rock, AR, 72205, USA

James Y. Suen und Vladimir P. Zharov

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VPZ hat die Studie entworfen und die Arbeit verfasst; HJJ, ACY, YAM und JYU entwickelten technische Plattformen; MS entwickelte Software und Signalverarbeitung; HJJ, ACY, YAM führten eine PA-bezogene Studie durch; ACY und DN führten eine PT-bezogene Studie durch; JSS stellte Malaria-Tiermodelle zur Verfügung, JNA und SP stellten für den Menschen relevante Proben und zugehörige Bewertungen bereit; FW und ASB führten eine Charakterisierung der Proben durch; SP hat das Papier bearbeitet. Alle Autoren haben die endgültige Version des Papiers gelesen und sich darauf geeinigt.

Korrespondenz mit Vladimir P. Zharov.

VPZ, JYS und UAMS haben ein finanzielles Interesse an der in dieser Veröffentlichung diskutierten Technologie. VPZ und JYS sind beide finanziell an CytoAstra, LLC beteiligt, das die in dieser Forschungsarbeit vorgestellte Technologie lizenziert hat. Diese finanziellen Interessen wurden gemäß den UAMS-Richtlinien zu Interessenkonflikten überprüft und genehmigt. Die anderen Autoren haben keinen Interessenkonflikt im Zusammenhang mit diesem Manuskript.

Springer Nature bleibt neutral hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten.

Ergänzendes Video S1.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Jawad, HJ, Yadem, AC, Menyaev, YA et al. Auf dem Weg zum tragbaren Regenbogen-Zytophon mit Laserdioden für die globale Krankheitsdiagnostik. Sci Rep 12, 8671 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-11452-w

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Eingegangen: 06. Oktober 2021

Angenommen: 18. April 2022

Veröffentlicht: 23. Mai 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-11452-w

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